我們真的掌握了上帝之手嗎?3D列印人體器官技術的前世今生(下)

在上篇中，我們回顧了組織器官工程技術的緣起。那究竟SEED AWARD 2019大獎得主以色列Matricelf團隊，是如何在前沿技術的基礎上，攻破了3D列印器官的一系列難題的呢？

核心技術沉澱，器官工程不再遙遠

Matricelf團隊的研究背後，涉及細胞和非細胞物質分離、細胞重編程、細胞誘導分化為心臟細胞和內皮細胞、細胞外基質（ECM）水凝膠環境搭建等多種技術，是一整套前沿技術的系統工程，除了本身極高的技術壁壘之外，還涉及跨學科應用、工藝流程和系統化等問題。為了便於理解，我們可以其類比為傳統的列印技術，分為「墨水」、「載體環境」和「印表機」三類。

圖：Matricelf團隊將體外細胞培養、再

「墨水」——iPS cell 誘導式多能幹細胞技術

2006年，日本京都大學的山中伸彌教授團隊發現，只需將Oct3/4、Sox2、c-Myc以及Klf4四種與幹細胞特性相關的轉錄因子（也被稱為「山中因子」）通過反轉錄病毒的方式導入小鼠皮膚纖維母細胞，就可以促使纖維母細胞重編程，形成具有多能性幹細胞的分化能力。這樣的細胞被稱為誘導式多能幹細胞（iPS cell）。2012年，因對「體細胞重編程技術」的研究，時任京都大學教授的山中伸彌獲得當年的諾貝爾生理或醫學獎。

圖：誘導式多能幹細胞(iPS)可以將體細

誘導式多能幹細胞與胚胎幹細胞（ES）形態相似、核型、端粒酶活性、體外分化潛能均相同，同時也能夠表達相同的表面標誌分子。簡單理解，即通過誘導式多能幹細胞技術重編程得來的iPS細胞具備和胚胎幹細胞一樣的多種分化能力，使得在體外誘導分化出心臟細胞、神經細胞、上皮細胞等器官組成細胞成為可能，為器官3D列印提供了「細胞墨水」支持。

Matricelf團隊採用從人體胃部大網膜提取出來的基質細胞，使用誘導式多能幹細胞技術將其「重編程」為iPS細胞，並且再誘導分化出3D列印心臟所需要的心臟細胞和上皮細胞，作為3D列印的材料。

「載體環境」——ECM 細胞外基質水凝膠

ECM，即細胞外基質，是由細胞分泌到細胞外間質中的大分子物質，其能構成複雜的網架結構，支持並連接組織結構、調節組織的發生和細胞的生理活動。之所以稱其為「載體環境」，是因為可以類比傳統的金屬粉末3D列印——為了使列印中的粉末材料和整個列印環境受保護，金屬粉末3D印表機會將整個列印環境充滿氬氣等惰性氣體，氬氣就是金屬粉末3D列印中的「載體環境」。在器官3D列印中，細胞和膠原蛋白是列印的「墨水」，為了使列印出來的細胞不受物理破壞，也需要有「載體環境」進行保護，這時候就需要含有ECM的水凝膠來做支撐。

圖：ECM水凝膠支撐細胞結構不受物理破

需要說明的是，ECM水凝膠除了保護的作用外，在臨床前研究中已經被證明其對某些疾病有潛在的療效，比如由於外周動脈疾病引起的血液循環不良。心臟病發作後，疤痕組織的形成會削弱心肌功能，導致心力衰竭。而此時一旦注射ECM水凝膠到受損的心肌中，ECM水凝膠就會形成一個健康細胞遷移的修復環境，導致心肌增加，疤痕組織減少，心臟功能改善。因此，ECM水凝膠環境對細胞列印的自修復自癒合有促進作用。

「印表機」——懸浮水凝膠自由形式可逆嵌入（FRESH）技術 /犧牲寫入功能組織（SWIFT）技術

器官3D列印的重頭戲自然是被歸為「印表機」的兩種技術——FRESH技術（懸浮水凝膠自由形式可逆嵌入技術）和SWIFT技術（犧牲寫入功能組織技術）。

圖：FRESH技術圖解

FRESH技術是由卡耐基梅隆大學的Adam Feinberg教授團隊研發的創新3D生物列印技術，以膠原蛋白（即ECM的主要組成成分）和細胞為目標列印材料，製造出具有更高解析度、圖案可以更複雜的人體器官組織支架。但膠原蛋白和細胞都是液態的，為了讓讓膠原蛋白保持完整的組織形狀，同時保持高解析度和高保真度，團隊開發了FRESH技術——該技術以明膠作為支撐床，特定濃度的膠原蛋白從靈活的列印噴嘴中擠出後，可以在支撐膠中逐層沉積和凝固。等到列印完成，研究人員把溫度從室溫調整到體溫（37度），就可以讓支撐用的明膠融化，同時讓列印出來的膠原蛋白結構、嵌入膠原蛋白中的細胞保持完好。

利用FRESH技術，科學家用細胞和膠原蛋白成功列印出不同尺寸的心臟零件：小到毛細血管，大到與新生兒心臟相當的人類心臟模型，包括血管系統、腔室之間的瓣膜等結構。而且，解析度最高達到20微米，大大超過原有技術100~500微米的解析度。

圖：利用FRESH技術列印的心臟零件模型

SWIFT技術則是由哈佛大學Wyss生物啟發工程研究所研發的3D列印血管通道技術。相比FRESH技術，據媒體報導「SWIFT專注於列印支持含有大量器官構建塊（OBB）的活體組織構建所必需的血管，而不是試圖3D列印整個器官的細胞，而最終可用於治療以修復和替換人體器官。SWIFT技術首先將數十萬個多能幹細胞聚集體混合ECM水凝膠形成一個密集的活體OBB基質，每毫升含有約2億個細胞；第二步，通過寫入和去除犧牲油墨建立血管網絡，氧氣和其他營養物質通過血管網絡可以被輸送到嵌入基質內的細胞」。

在0到4度的低溫下，混合ECM水凝膠和多能幹細胞的緻密基質具有足夠的稠度和柔軟度，使其可以在不損壞細胞的情況下進行3D列印的噴塗操作；而當基質被加熱到37度時，基質會變硬，基質中的明膠部分會融化並可被簡單清除，留下3D列印的血管通道。

如何提高細胞列印的存活率？——冷凍3D列印及並行印刷技術

器官列印目前還面臨列印速度慢、細胞存活率不高的瓶頸。而SEED AWARD 2019北美賽區十強項目中，RS3Dprint團隊帶來了創新的解決方案。傳統組織3D列印中，無論是細胞還是其他材料，都是逐層列印，不斷堆疊，即「分層物體製造」（LOM)。這種方法不僅會造成細胞層之間互相擠壓導致細胞死亡，過長的列印時間也很難使得大部分細胞保持活性。加州大學伯克利分校機械工程學院著名教授Boris Rubinsky就提出，可以像工業流水線一樣進行列印流程拆解：多臺印表機並行工作，每臺印表機列印單層細胞結構，列印完之後馬上對單層細胞進行精確冷凍保證存活率。在「中央組裝廠」（類似汽車生產流水線的總裝車間），再把不同層組織進行連接，最終「總裝」成為3D結構。這種方法被團隊稱為「Cryoprinting」（冷凍3D列印）及「Parallel lithography」（並行印刷），通過實驗和計算表明，該技術可使每立方米產品的大規模生產時間縮短數千小時, 同時大大提高組織列印的細胞存活率。

圖：Boris Rubinsky教授提出的並行印刷

目前，Boris教授正將這種生物3D列印技術應用於食品工業。2019年大火的人造肉公司Beyond Meat和Impossible Food的產品，都是模擬碎肉餅，尚無完整的肉質結構出現。通過逐層列印和統一總裝，可以大大縮短人造肉列印的時間成本，同時還能精確控制肉質口感，列印出真正具有肉質纖維紋理和口感的產品。

圖：通過逐層冷凍列印、統一總裝的列印

圖：Boris Rubinsky 教授帶隊參加SEED

值得一提的是，Boris Rubinsky教授是一位跨學科、高產的真正創想者。其研究領域包括醫療影像、生物醫藥、低溫醫療、微納米仿生技術等。早在1982年，他便與Gary Onik教授一起，首次利用超聲波為腫瘤冷凍治療進行定位和監測，開創了影像引導的冷凍治療學，大大提高了冷凍治療的準確性和可靠性。該技術逐漸成熟演變成為今天的氬氦刀技術（氬氦冷凍消融技術），目前已經廣泛應用於肺癌、肝癌等多種癌症治療手術。

十年磨一劍，組織器官工程技術到達黎明前夜

經過數代創想者不懈努力，伴隨人體器官移植、動物器官移植、人造器官、誘導式多能幹細胞技術、ECM細胞外基質水凝膠開發、FRESH 懸浮水凝膠自由形式可逆嵌入技術 / SWIFT 犧牲寫入功能組織技術、冷凍3D列印-並行印刷技術等多個子領域的發展，組織器官工程技術已經走進現實。

Matricelf帶來新暢想

2019年4月，特拉維夫大學分子細胞生物學與生物科技學院的Tal Dvir教授團隊成功利用患者自身的脂肪細胞和生物材料「列印」出了世界上第一個擁有血管、完整心室和心房的3D工程化心臟。經過特拉維夫大學技術轉化組織（TTO機制）的孵化，2019年下半年Matricelf正式成立，團隊開始承擔3D心臟列印項目的商業化運營。

圖：Matricelf正在進行心臟列印

Matricelf團隊研發並工程化的3D心臟列印技術，其生物材料源自全部患者本身身體內的細胞，在世界範圍內首次突破了傳統器官移植採用的異體移植帶來的長期持續且劇烈的排異反應問題，有望徹底免除患者長期服用免疫抑制劑的痛苦。這一重大醫學突破為人體器官移植和組織器官工程的發展開闢了新的道路。

Matricelf團隊在SEED AWARD全球總決選現場帶來的列印心臟樣品長度只有2.5釐米，和兔子的心臟大小相仿，並且心臟上的細胞還不具備泵血功能，僅能收縮，但它擁有與人類心臟相同的腔室和血管，後續可以利用相同的工業化技術製作真正的人類心臟。雖然目前研究的前沿方向還面臨擴展多種生物材料「墨水」、億級大批量細胞列印等工程化難題，但距離列印一個真正可以運作的人體心臟可能僅需要不到十年時間。

作為一個商業化項目，Matricelf制定了不同階段的目標。目前其核心應用場景為脊髓損傷修復。脊髓損傷修復和心肌梗塞修復都是三大核心技術之一——「載體環境」ECM水凝膠的工程化應用。要最終實現臨床的心臟列印，必須先將三大核心技術成熟落地，而脊髓損傷修復是將ECM水凝膠技術成熟落地的方向之一，目前學術界對這個方向有較多研究。

圖：ECM凝膠修復心肌

當然，Matricelf團隊還需解決一系列更加複雜、實際的問題：

橫向拓展更多種類細胞、纖維蛋白、透明質酸、藻酸鹽等各種軟性生物材料等多種「墨水」材料，完善列印能力；（要列印完整的心臟，至少需要列印四種心臟組成細胞，因此必須完善列印能力）未來要列印相同尺寸的人體器官需要上億級別細胞的列印技術，對器官3D列印技術的批量工作能力、列印精度、連續生產能力等都有更高要求；「印表機」、「墨水」和「載體環境」三大核心技術的工程化落地和商業化探索。在接下來的十年長徵裡，追求精益創業的Matricelf團隊已經有了明確的分步商業化策略，而基於ECM水凝膠技術的脊髓損傷修復解決方案和急性心肌梗塞修復解決方案是接下來團隊商業化進程的重要發力方向。不管是「墨水」iPS cell、「載體環境」ECM水凝膠或者「印表機」FRESH/SWIFT技術，其每一項在各自領域都是非常前沿的技術，基於以上核心技術，逐一拓展工程化和商業化能力，分化出大量「微創新」解決方案，是Matricelf團隊商業化策略的重中之重。最終，在3D心臟列印技術的這顆超級大樹下面，將會包括脊髓損傷修復、心肌梗塞修復等眾多疑難雜症的解決方案。

發展趨勢

組織器官工程前景廣闊，需求非常強烈：雖然每年有超過3萬例器官移植手術，但是還有超過11.3萬名患者在等候器官移植。我們推測未來的主要研發方向包括：

FRESH/SWIFT技術是平臺性技術，未來需要橫向拓展纖維蛋白、透明質酸、藻酸鹽等各種軟性生物材料等多種「墨水」材料，完善列印能力；當前的3D列印技術還只能列印等比例縮小的器官，未來要列印相同尺寸的人體器官需要上億級別細胞的列印技術，對器官3D列印技術的批量工作能力、列印精度、連續生產能力等都有更高要求；除了3D列印技術外，並行的幾種技術路線：比如微模具成型技術、微流體紡絲技術等在近幾年都有長足的發展，未來會綜合運用在組織器官工程的不同領域。上篇回顧

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