ACS Biomater. Sci. Eng.：將微結構化的電紡支架集成到開放的微流控系統中，以體外研究人源性原代細胞
DOI: 10.1021/acsbiomaterials.0c00352
最近的研究表明，微環境刺激在調節細胞增殖和遷移以及調節具有幹細胞（SCs）特性的乳腺細胞的自我更新和分化過程中起著重要作用。目前，微/納米技術和生物材料合成/工程方面的最新進展使構建適合於體外幹細胞維持和分化的創新組織培養平臺成為可能。在此，研究者報告了一種開放式微流控設備（OMD）的設計和製造，該裝置集成了可移除的聚己內酯（PCL）為基礎的電紡支架，並且證明OMD可以實時研究體外培養過程中人類細胞的行為。具有改良的表面形貌和化學性質的電紡支架可以影響乳腺幹細胞的附著、增殖和分化，以及根據特製的纖維後處理所賦予的特定形態或生化線索來維持管腔細胞特性的表觀遺傳機制。同時，OMD體系結構允許控制細胞的接種和培養條件，以收集更準確和有用的體外測定。從長遠角度來看，可以定製集成系統來模擬局部微環境的特定生理條件，然後分析篩選特定藥物的反應，從而在個性化醫學中進行更有效的診斷、長期預測和疾病幹預。
圖1.圖A：PCL支架製備和表面改性方法的示意圖。在高壓作用下，通過將帶電的流體噴射沉積到金屬面上來生成PCL纖維膜。這些樣本用作對照（類型S1）（上圖）。通過引入親水性官能團（S2型），對PCL膜進行NaOH處理以改變表面化學性質（中心圖）。NaOH處理的PCL膜進一步用聚陽離子溶液處理，直到形成殼聚糖塗層（S3型）（下圖）。B圖：組裝好的設備的圖片。C圖：用於將PCL膜集成或移除到微流控裝置中的裝置布局和程序。將PCL支架放置在PDMS室中，然後用可移動的PDMS框架固定到位。D圖：單個腔室的剖面圖。微腔室的邊緣充當多孔膜的支架，框架的插入可以將其可逆地固定在適當的位置，避免使用密封劑或粘合劑。開放的腔室便於進入細胞。
圖2.使用3D列印和複製成型方法製造PDMS微流控多層設備的過程。A圖：母版的製作。圖案的CAD設計（A1），使用立體光刻系統（A2）進行塑料母版的3D列印，以及母版的矽烷化（A3）。B圖：複製成型過程。將10:1的PDMS預聚物分配到母版（B1）上，進行交聯（B2），然後將PDMS複製品與底片分開（B3）。C圖：組裝多層裝置。將預聚物旋塗到蓋玻片（C1）上，將器件層著墨到蓋玻片（C2）上，在組裝好的三層裝置（C3）的烘箱中對齊並固化。D圖：3D列印的母版和副本的圖片。培養室（母版I）、微室以及微通道的母版（母版II）（左）；從母版II（中央）上剝離副本；組裝前母版I（頂層設備層）和II（中間設備層）的PDMS副本，以及三個PDMS框架，用於拉伸培養室和微室之間的不同支架（右）。
圖3.PCL基電紡纖維。經NaOH處理（S2）的電紡纖維和用作對照（S1）的未經處理的PCL纖維的AFM高度（A和C）和振幅圖像（B和D）。直方圖顯示了歸一化的表面粗糙度、纖維的平均直徑和附著力值。測量單位：nm表示粗糙度，μm表示平均直徑，mN表示附著力。觀察到表面粗糙度略有增加，並且纖維的平均直徑減小。PCL電紡纖維的形態分析：低（上）和高（下）放大SEM圖像（E）。通過圖像分析測量孔隙度（F）和孔徑（G）。數據表示為平均值±標準偏差（SD）。標有（***）的樣本表示兩組之間存在統計學上的顯著性差異（P***<0.001）。
圖4.在不同的PCL支架條件S1、S2或S3下，培養的人類患者來源的MM細胞的相差（PC）和螢光圖像。用表達eGFP的慢病毒轉導的具有SC特性的細胞產生MMs。分散的MMs細胞在OMD中培養7天。頂部和底部圖片代表培養第3天（頂部）或第7天（底部）的細胞接種在未處理的（S1）、NaOH處理的（S2）和殼聚糖塗層的（S3）PCL支架上。
圖5.在不同的PCL支架條件（S1，S2或S3）下培養的人類患者來源的MM細胞的單細胞活力分析。圖A：通過FACS獲得的代表性點圖：用藻紅蛋白（PE）螢光通道檢測到的活細胞DNA的碘化丙啶（PI）染色表明，在S1，S2和S3條件下細胞活力相似。每次FACS分析大約使用50,000個細胞。X軸是PI染色與DNA結合的相對強度，以對數刻度顯示。Y軸是以線性比例顯示的細胞側向散射。PI摻入的百分比越高表示由於凋亡、壞死或吞噬作用而導致細胞膜受損的細胞（圖C）。對照是未經PI染色（NS）的細胞。B圖：在經紫外光處理的NaOH-PCL（S2）上培養對照細胞以誘導細胞死亡。C圖：從每種PCL條件的3次重複實驗的平均值獲得的細胞活力分析的總結，垂直條為s.e.m的+/-。活細胞是不經PI染色的細胞。圖D：PI細胞染色顯示比例為5％，表明在所有PCL培養條件下細胞生存力相似。
圖6.在S1、S2或S3 PCL上培養的人類患者來源的MM細胞的細胞增殖分析。圖A：對於在S1、S2或S3上培養的細胞，細胞核的PI染色在細胞周期的所有階段均未顯示出顯著性差異。染色體倍性2N、2N-4N和4N由PI結合DNA的相對強度確定。FACS生成的直方圖：縱軸是以線性刻度顯示的相對細胞數，橫軸是以對數刻度顯示的PI結合到每個細胞DNA中的相對強度。每次FACS分析大約使用50,000個細胞。對於每種PCL培養條件，將實驗重複3次。B圖：從每種PCL條件的3次重複實驗的平均值獲得的細胞周期分析的總結，垂直條為s.e.m.的+/-。
圖7.在不同PCL支架條件（S1，S2或S3）下培養的人類患者來源的MM細胞中的Ki67蛋白免疫組織化學檢測。相位對比（PC）和DAPI螢光（藍色）合併圖像，Ki67螢光（綠色），Ki67和DAPI合併的螢光圖像。
圖8.在S1、S2或S3 PCL條件下培養的患者來源的MM細胞中，管腔標誌物的qRT-PCR表達分析。對以下獲得的cDNA進行CK18和CDH1表達分析：來自患者產生的MMs細胞，所述MMs在懸浮條件下培養（MM）；從未經處理的（S1）、經NaOH處理的（S2）或殼聚糖塗層的（S3）PCL支架以及非惡性人類乳腺細胞系（MCF10A）採集的細胞。表達相對於GAPDH(圖A)或HPRT(圖B)管家基因進行歸一化，這些基因作為內源性對照，用於相對定量管腔標記物表達。C圖：HPRT1和GAPDH表達的平均值用作相對定量的內源對照。數據表示為3次重複實驗的平均值。豎線表示置信區間CI => 95％。相對於S2，顯著性水平為P**=<0.01和P***=<0.001。結果來自3個獨立實驗。圖D：用3％瓊脂糖凝膠電泳分析在qPCR擴增終點獲得的RT-PCR產物。來自以下物種的cDNA的HPRT1（103 bp）、GAPDH（75 bp）、CK18（104 bp）和CDH1（104 bp）的擴增子：乳腺球（MM），S1，S2，S3，MCF10A（MCF）以及無cDNA模板的PCR陰性對照（C）。GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder（＃SM0321，Thermo Fisher）。
圖9.圖A：在S1、S2或S3 PCL培養條件下培養的患者來源的MM細胞中CDH1的免疫組織化學檢測。在PCL支架條件下（S1，S2或S3），DAPI（藍色）染色細胞核中CDH1（紅色）的免疫組織化學檢測。相位對比（PC）和DAPI螢光合併圖像，DAPI螢光，CDH1螢光（紅色）和DAPI合併圖像。B圖：在S1、S2或S3 PCL培養條件下培養的患者來源的MM細胞中CK18的免疫組織化學檢測。PC和DAPI螢光（藍色）合併的圖像，DAPI螢光，CK18螢光（紅色），CK18和DAPI合併圖像。
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文章來源：易絲幫