《細胞》子刊11篇文章重磅回顧,這些年興起的大牛技術

 

還記得CRISPR-Cas9基因組編輯技術，cryo-EM，甚至高通量測序技術未出現之前，我們是怎樣進行研究的嗎？其實大家不用回憶太久，因為這不是很久以前的事。在過去幾年間，生物學研究技術進步步伐快的讓人難以置信。

Cell出版社旗下Molecular Cell雜誌推出了技術特刊，介紹了新技術的發展，以及這些技術對研究和臨床醫療的影響。一整期的內容都在描述功能強大的新興工具技術，回望我們已經走過的路，以及未來即將要踏上的徵程。其中有十一篇綜述性文章介紹了近年來的重頭技術。

高通量測序技術

人類基因組測序技術正在徹底改變我們對於生物學，人類多樣性以及疾病的理解。從第一份測序草圖，到個人基因組與基因組醫學時代的到來，幾乎都來自過去十年間DNA測序技術的飛躍發展。「High-Throughput Sequencing Technologies」探討了常用高通量測序平臺的發展，相關的檢測方法，以及目前測序平臺及其臨床應用所面臨的問題。

其中尤為值得注意的是近期Oxford Nanopore公司的掌上測序儀MinION早期試用項目的結果，一些大學的研究團隊發表了使用MinION獲得的研究成果，比如英國東安格利亞大學的研究人員用MinION鑑定了一種多重耐藥菌的抗性基因。這項研究表明，這一技術能夠很好的用於傳染病診斷。研究人員指出，低成本速度快的納米孔測序與短讀取測序結合，能夠為人們提供組裝完全的細菌基因組，相信公共衛生機構和臨床實驗室很快就能從中獲益。此外，納米孔測序系統經過進一步改良之後，將不再需要短讀取數據。

單細胞測序技術的進展與應用

單細胞測序（SCS）是研究稀少細胞，解析複雜組分的重要工具。在過去五年間，DNA和RNA方面的SCS技術對包括微生物學、神經生物學、發育生物學、組織嵌體、免疫學和癌症研究等諸多領域都產生了廣泛的影響。「Advances and Applications of Single-Cell Sequencing Technologies」討論了SCS技術，和其在轉化醫學中的應用。

比如來自加州大學的研究人員利用最新技術分析單個細胞中的基因活性，確定了發育大腦中細胞的獨特特性。他們使用的技術主要集中在一個「微流體」設備，在這個設備中單個細胞被捕獲並流入納米級的小室中，那裡它們有效而精確地進行DNA測序所必需的化學反應。研究表明，確定和拼出獨特序列，並成功地確定細胞類型所需要的閱讀步驟數量，比原先估計的少100倍。這項技術，是由Fluidigm公司開發，可同時用於96個細胞的單獨過程。

單細胞RNA測序技術

單細胞生物和多細胞生物中單個細胞之間的差別都會產生重要的功能影響。近期研發的單細胞mRNA測序方法能幫助科學家們無偏向性，高通量，和高解析度的解析這些單細胞。

這種方法相較於針對批量種群細胞的傳統方法，為轉錄組學提出了更多的維度。目前單細胞RNA測序技術已經揭示了生物組織、轉錄動力學、基因之間調控關係的重要新機制。細胞捕獲、細胞分型、分子生物學和生物信息學快速的技術發展為未來生物學和醫學上的應用鋪平了道路。

近期EMBL研發了一種可以在細胞解析度上同時檢測成千上萬個基因的新技術，研究人員使用單細胞RNA-seq，擴大海洋蠕蟲（Platynereis dumerilii）的大腦基因表達圖譜。這種方法方法可讓研究人員匹配定量數據和空間數據，將標記提高了幾個數量級，這些標記可顯示一個組織中的特定細胞類型。因此，一個更廣泛的模式可能開始出現。

同時Affymetrix eBioscience也推出了第一個可同時檢測單細胞水平的RNA和蛋白質表達的技術平臺：PrimeFlow RNA Assay。這一技術的主要優勢在於當相應蛋白質的流式抗體表現不佳或無法獲得時，能高度靈敏地檢測mRNA，此外，隨著人們逐漸認識到非編碼RNA的關鍵功能作用，直接測定異質細胞群中非編碼RNA也將是一個趨勢。

Fluidigm公司也在美國神經科學學會的會議上宣布推出一個新流程，能實現高通量的單細胞mRNA測序。這個流程綜合了集成流體通路（IFC）設計的顯著進步，可大規模提高通量和易用性，同時降低單細胞製備的成本。

設計特殊細胞類型全基因組實驗

多細胞生物需要各種特殊的細胞類型進行分化來維持生存。這些細胞有其特殊的發育過程，和對環境挑戰不同的應對方式，而這些都是通過相同的遺傳圖紙來指導完成的。因此現代生物學的一個關鍵問題就是了解這些基因如何在正確的位置上，在正常的時間裡，表達正常的水平量，而且在許多疾病中，這種精細的基因表達調控 會被擾亂。因此了解這些意義重大。

「Designing Cell-Type-Specific Genome-wide Experiments」綜述指出，近期一些新興技術能利用細胞類型特異性方法，捕捉全基因組範圍內基因表達，這些新技術幫助研究人員以前所未有的清晰度來了解體內的基因調控，讓我們對多細胞生物如何適應環境有了更深的理解。這篇文章探討了如何從最開始的材料，篩選合適的對照，驗證數據，設計自己的特殊細胞類型實驗。

螢光蛋白探針

光學成像和基因工程研究方面的進展推動了生物可視化新技術的發展。目前一些像是基於螢光蛋白FPs的遺傳編碼指示因子可以用於對離子、分子和酶的活動進行成像，正如錢永健Roger Tsien所說的，「在細胞中上演碟中諜」，這些指示因子能進入特殊的組織、細胞類型或亞細胞結構中，報告它們特殊的細胞內活動。

「Molecular Spies for Bioimaging—Fluorescent Protein-Based Probes」這篇綜述概括了目前的單分子報告因子，這些因子能將蛋白的構象變化轉換成螢光信號，許多報告因子都可以用於螢光共振能量轉移和單FP方法。

去年同一時期，來自瑞士洛桑聯邦理工學院的一組研究人員開發了一種可以很容易地進入活細胞的新螢光分子，這種分子無毒且具有持久的信號，最重要的是，可提供前所未有的圖像解析度。

這種探針，稱為SiR-微管蛋白和SiR-肌動蛋白，被用來可視化人類皮膚細胞中的細胞骨架動態。因為探針的光信號是以遠紅光發射，所以很容易將它從背景噪聲中分離出來，當使用一種稱為超解析度顯微鏡的技術時，會產生前所未有的高解析度圖像。

單細胞水平上的活細胞結構和動態成像

觀察活細胞分子進程是定量了解生物學系統功能的一種重要方法，尤其是在單分子水平上解碼細胞複雜行為有助於我們理解動力學，轉運，和自組裝過程。

在過去十年間，螢光顯微技術，螢光相關光譜和螢光標記技術的快速發展令我們能以高解析度觀察不同分子作用機制的複雜性和隨機性。「Imaging Live-Cell Dynamics and Structure at the Single-Molecule Level」這篇綜述探討了單分子水平活細胞結構和功能成像新概念和技巧。

定位泛素信號

泛素（UB）信號系統在生物體內十分常見，也常常與其他類型的翻譯後修飾（PTMs），如磷酸化共同作用。但是至今我們對於這種信號途徑的動力學機制和限速中間體了解的很少。

「Quantifying Ubiquitin Signaling」這一文章回顧了過往如何利用定量蛋白質組學工具，以及富集策略分析泛素信號系統，如何將這一信號途徑與調控磷酸化事件，PINK1/PARKIN途徑聯繫在一起。同時泛素化作用的一個關鍵特點是找到泛素途徑鏈對下遊進程的調控方式。這篇文章也描述了如何利用蛋白質組學和酶學工具識別和定量分析泛素鏈合成過程，以及關聯傾向。文章指出，制定定量蛋白質組學將能為解析泛素信號途徑生化機制提出一個新的標準。

今年一項新研究發現了泛素的新作用：泛素化有著與蛋白降解無關的另一種功能，可以幫助細胞抵禦壓力。研究顯示，一種特殊的泛素化（K63）能夠修飾並穩定核糖體，而核糖體是蛋白合成的發動機。研究人員發現，阻止酵母建立K63泛素鏈，會使蛋白產量大幅削減，結果細胞對壓力條件高度敏感。研究人員是在酵母中研究K63泛素鏈的，不過這種泛素化也出現在小鼠的神經元。這說明泛素化的新機制也存在於哺乳動物中，很可能與人類健康有關。

Cryo-EM：獨特的大分子複合物研究工具

3D低溫電子顯微鏡（cryo-EM）雖然是結構生物學研究中的重要工具，但其潛力還未充分發揮出來，近期這一技術解析度獲得了一個飛躍性發展，在生物學系統中應用也越來越多。由於這一技術並不要求一定要結晶，樣品量需要的也少，而且可以在計算機中成像分類，因此cryo-EM可以用於處理許多複雜構象成分的混合物。

「Cryo-EM： A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity」綜述介紹了這一技術單顆粒分析的主要原則，並探討了近期這一技術應用的關鍵問題。而且文章還特別強調了一些目前正在進行的新技術，其中許多將能實現之前無法完成的解析度「夢之隊」。

美國國立癌症研究所NCI近期達到了cryo-EM成像迄今為止的最高解析度（2.2 ？），此前只有X射線晶體衍射達到過這種水平的解析度。這能為人們提供足夠的結構信息，進行更好的藥物研發。

定義代謝的大小，流量和調控

過去二十年裡代謝研究促進了代謝技術的爆炸性發展，首當其衝的就是具有「非定標性（untargeted metabolomics，生物通譯）」和「探索性」的代謝組學方法（metabolomics），這種技術的實驗目標是全面衡量整個代謝，其中涉及大量未定義的分子組。由於代謝組學的全覆蓋性，因此對於尋找某個代謝研究問題答案的科學家來說，這成為了第一選擇。但是找到非定標性代謝組學也不一定就是最佳實驗選擇，傳統方法中非定標性代謝組學只能提供代謝池尺寸相對差異的信息。因此這還是取決於各自研究的項目，穩定同位素（stable-isotope）檢測方法也是不錯的選擇。

「Defining the Metabolome： Size， Flux， and Regulation」詳細介紹了這方面的內容。

癌細胞圖譜項目：尋找癌症的特徵網絡

DNA測序技術進步幫助科學家們發現了癌症基因組中成千上萬的體細胞突變，展現了癌細胞令人驚訝的複雜性，但是目前還尚不清楚哪些是促進癌症發生發展的關鍵驅動突變，哪些是被動突變，以及這些突變對於發病機制的影響，對治療的應答反應。

雖然相似類型的腫瘤和臨床療效也許會告訴我們突變作用模式截然不同，但是顯然這些突變確實具有一些相同的分子途徑和網絡作用特徵。因此要想成功解釋癌症基因組，就需要全面了解致癌發生過程中選擇性壓力的分子網絡。

「The Cancer Cell Map Initiative： Defining the Hallmark Networks of Cancer」這篇文章宣布了這一研究方向的又一重要舉措：癌細胞圖譜項目（CCMI），這一項目主要旨在系統地詳細說明癌基因之間的複雜關聯，以及它們在疾病和健康狀態下的差異。文章也探討了近期這方面的成果，以及其對精密醫學的影響。(生物谷Bioon.com)