新型NADH螢光探針問世 實現細胞代謝實時檢測與成像

　　在國家自然科學基金重大研究計劃、國家傑出青年科學基金項目和面上項目的資助下，華東理工大學楊弋教授團隊開發了一系列特異性檢測還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的高性能遺傳編碼螢光探針iNap，相關研究成果以「Genetically encoded fluorescent sensors reveal dynamic regulation of NADPH metabolism」(遺傳編碼的螢光探針揭示NADPH代謝的動態調節)為題於2017年6月5日以「研究長文」的形式在線發表在Nature Methods，2017年7月28日正式刊出。陶榮坤博士、趙玉政研究員和初環宇博士為共同第一作者。華東理工大學楊弋教授和中國科學技術大學劉海燕教授為文章的共同通訊作者。

　　煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH/NAD+)及其磷酸化形式(NADPH/NADP+)，作為生物體內兩對最重要的輔酶和核心代謝物，常被用作評價細胞代謝狀態的關鍵指標，與衰老及相關疾病如癌症、糖尿病、肥胖症、心腦血管疾病、神經性退行性疾病等的發生發展密切相關。長久以來，細胞代謝的檢測主要依賴酶學、色譜、質譜等，這些方法不僅破壞了細胞或生物體的完整性，更難以應用於高通量篩選。為了解決這一重要科學難題，2011年，楊弋教授團隊利用合成生物學方法開發了一系列遺傳編碼的NADH螢光探針，實現了在活細胞及各種亞細胞結構中對NADH分子的實時動態、特異性的檢測與成像(Cell Metabolism, 2011, 14, 555)。2015年，該團隊又報導了可同時檢測NAD+，NADH及其比率的第二代細胞代謝螢光探針NADH氧化還原比率探針(SoNar)，像火眼金睛一樣，可察覺到癌細胞與正常細胞的微細代謝差異(Cell Metabolism, 2015, 21, 777)。並進一步建立了細胞代謝螢光探針在單細胞、活體動物成像及高通量藥物篩選方面的系統研究方法(Nature Protocols, 2016, 11, 1345)。

　　NADH和NADPH的螢光光譜相似，但是二者的生理功能卻顯著不同。NADH主要參與物質能量代謝，而NADPH主要參與合成代謝以及抗氧化，傳統的自發螢光分析方法很難區分這兩種小分子。該研究團隊在第二代NADH螢光探針SoNar的基礎上，通過對底物結合蛋白的理性設計和改造，開發了一系列高性能遺傳編碼螢光探針iNap，特異性檢測NADPH，實現了在活體、活細胞及各種亞細胞結構中對NADPH代謝的高時空分辨檢測與成像。該研究首次報導了癌細胞內不同亞細胞結構中游離的NADPH水平，發現了氧化應激時癌細胞內NADPH代謝受葡萄糖水平動態調節。研究團隊也進一步發現人體內源性類固醇激素DHEA通過抑制G6PD活性和激活AMPK活性，對NADPH代謝實現雙向調節作用。鑑於AMPK信號通路在衰老、糖尿病、肥胖症以及癌症中的重要角色，這一研究結果有望破解DHEA作為一種藥物和膳食補充劑在這些疾病方面發揮出的有益作用。NADPH作為細胞內的還原力，在生理或病理條件下發揮重要角色。該研究報導的細胞代謝螢光探針iNap，不僅可應用於抗氧化、AMPK、脂肪酸合成等代謝途徑與通路分析，也可用於衰老及相關疾病創新藥物的發現。

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