發光細菌在線監測水體汙染將向更穩定更高靈敏度更低檢出限發展

導讀

發光細菌法作為在線生物毒性監測方法之一，被廣泛應用在水汙染監測中，也是商品化應用最好的生物毒性技術。未來的發光細菌法如何發展？未來的生物毒性監測技術將會隨著發光細菌法的發展發生什麼樣的變化？讀完這篇文章，或許您會有所思考。

發光細菌作為可以進行生物發光的細菌，它的出現總是給人帶來神秘。漫步在海灘，當你看到沙灘上泛起的藍色螢光時，你感受到的是它的無限美麗與美好。其實，這些「藍色螢光」已經悄悄地在告訴你，這裡的水質情況，而你卻不自知。這些「藍色螢光」擁有統一的名字，即發光細菌。

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１、發光細菌監測水質生物毒性的原理

水樣在一定的時間和條件下與發光細菌接觸後，發光細菌的發光強度與水樣中毒性組分總濃度呈負相關關係，通過生物發光光度計測定水樣與發光細菌接觸15min後的發光抑制率來表徵水樣的急性毒性水平。發光細菌的生物發光反應是由於分子氧作用，細胞內螢光酶催化將還原態的黃素單核苷酸及長鏈脂肪醛氧化為黃素單核苷酸及長鏈脂肪酸，並釋放出最大發光強度在490nm處的藍綠光。生物毒性的表徵指標為相對發光強度或抑光率，相對發光強度是測試樣本發光值（樣品管發光值）與控制樣本發光值（對照管發光值）對比後所得，結果以百分比表示。抑光率一般為正值，有時候抑光率會呈現負值，此時說明水中存在使發光菌菌數增加的有機物，即可同化有機物(AOC)及可生物氧化有機物(BDOC)。

２、發光細菌監測水質生物毒性結果的評價

國家海洋局《汙水生物毒性監測技術規程 發光細菌急性毒性測試－費歇爾弧菌法》提到，樣品毒性水平的表徵方法採用檢測結果中的15min發光抑制率Ｈ進行評價。根據Ｈ大小將毒性等級分為３級，相應等級分別為低度毒性風險、中度毒性風險、高度毒性風險，分級方法如表１所示。中科院土壤研究所制訂的水質毒性分級標準中，根據相對發光率的大小將毒性等級分為低毒、中毒、重毒、高毒、劇毒５個等級，如表２所示。

表１汙水樣品毒性風險等級評價方法

表２水質急性毒性分級標準

３、發光細菌監測水質生物毒性的標準

目前，市面上應用最廣泛的發光細菌有３種：明亮發光桿菌、費氏弧菌、青海弧菌，如圖１所示。其中，明亮發光桿菌和費氏弧菌為海洋菌，青海弧菌為我國發現的淡水菌。ZnSO－4·7H2O對３種菌種的EC50（單一化學物質使抑光率達到50%時該物質的濃度）最小的為費氏弧菌，費氏弧菌的靈敏度更高。

（a）明亮發光桿菌；（b）費氏弧菌；（c）青海弧菌 圖1 3種發光細菌類型

表３列出了明亮發光桿菌(P.phosphoreum)以及費氏弧菌(Vibriofischeri)等所涉的國內外標準。ISO11348的３個標準，主要區別在於費氏弧菌的狀態不同：第１標準採用的是新鮮製備的費氏弧菌；第２標準採用的是液體幹細菌；第３標準採用是凍乾粉細菌。其中，ISO11348-3-2017是應用最廣泛的國際標準。涉及青海弧菌的暫時沒有標準，僅在《水和廢水監測分析方法》第四版書籍中提到。

ISO11348-3-2017與GB15441—1995相比，主要有以下兩點區別。（１）利用的發光菌不同，且保存菌種的溫度不同，前者用的是費氏弧菌，保存溫度為-20℃；後者為明亮發光細菌，保存溫度為２～５℃；因此，對於需要長期保存的凍乾粉而言，冷凍溫度越低越好。（２）前者要求測定加入水樣前發光細菌的原始螢光強度，並根據對照試樣做出校正，避免了細菌樣品不均勻帶來的誤差影響。

表３發光細菌監測水質生物毒性的標準

４、發光細菌在線生物毒性監測儀的研究現狀

4.1菌種製備技術發展

菌種技術的發展重點在於發光細菌凍幹製劑製備技術。菌種的凍幹製品直接由冰晶升華製成，具有多孔結構，既能使細菌保持原有活性，又不會破環細胞的形態以及特性。冷凍乾燥是將細菌懸浮液冷凍到冰點以下，從而轉變為固體結晶態，然後在低溫低壓（真空）下使固體升華而脫水的乾燥方法。與新鮮菌液相比，菌種製成凍幹製品後可以長期保存，簡化了發光細菌法的前期工作。楊毅紅等發明了一種海洋發光細菌凍幹製劑（明亮桿菌）及其製備方法，屬於微生物凍幹製劑範疇。該凍幹製劑包含菌泥和凍幹保護劑，且經菌液製備、菌泥製備、混合、預凍和凍乾等步驟製備而成。該保護劑製得的海洋發光細菌凍乾粉於２～８℃下保存18個月後，菌種恢復發光率及菌種發光性能均維持穩定，能極大地提高海洋發光細菌菌種的保存效果和質量，便於環境毒性檢測中對菌種的使用。

4.2菌種在線活化技術運用

商品化的生物在線監測儀一般維護周期為２周。發光細菌凍乾粉復甦後的有效期一般不超過10d，聚光科技和希思迪聯合開發的T3000運用了儀器菌種自動保存和在線活化技術，將維護周期延長到28d。趙東紅髮明了一種水質生物毒性在線檢測的裝置，包括制樣單元（水樣預處理單元）、機械手單元、取樣檢測單元及驅動分析單元，且制樣單元和取樣檢測單元均採用平行雙通道的技術方案，可實現參比水樣和待測水樣的同時測定，消除了系統誤差和測量偏差，設計了菌液儲存池和菌液復甦池，通過在線活化技術實現維護周期的延長。Bodini等研究了一種新型的細菌管理裝置，其由１個開瓶器和１個裝有凍幹細菌的３個小瓶的冷藏室組成。整個過程編程自動運行，包括打開小瓶、添加22mL的緩衝液復甦細菌、丟棄耗盡的細菌等操作。

4.3平行雙通道技術的應用

2010年，聚光科技TX2000採用的是單通道技術，蠕動泵將空白對照液和待測樣品按順序泵入流路，同時，蠕動泵也將緩衝液和菌液泵入流路，三者混合在混合環，混勻反應一定時間後到達光電檢測裝置。此時，軟體控制光電檢測裝置獲取有用的光信號，分別得到參比光度值和樣品的光度值。為了保證系統誤差和測量誤差的消除，運用平行雙通道可以實現參比水樣和待測樣品的同時測定。平行雙通道技術的運用也增加了儀器成本，主要是參比反應池和樣品反應池獨立分開、測試管路兩路、光電檢測器的增加等。

4.4信息化技術

傳統的在線監測儀器，其基礎的信息處理技術為設備驅動、實時監控、數據管理、遠程預警，但這已經不能滿足水質管理的要求，因此，通過信息化技術實現數據更高層次的利用是未來發展的方向。黃靜發明了一種在線生物毒性監測儀，對待測試水樣進行測試，得到水樣的水樣測試反應過程曲線以及抑制率。利用毒性物質毒性分級清單確定抑制率對應的毒性等級，利用曲線相似性算法對水樣測試反應過程曲線進行曲線形狀相似性識別，依據抑制率從標準毒性物質的反應過程測試曲線資料庫中識別相似度最高的反應過程測試曲線，並將其對應的毒性物質信息作為待測試水樣的毒性物質信息。該方法實現了對水質毒性信息的分級分類，解決了現有技術中無法對水質中毒性物質量化的問題，且通過曲線形狀相似性識別提高了分級分類的準確性。

4.5移動式監測技術應用

現有的在線生物毒性監測儀基本都是安裝在固定的自動監測站點來實現各類水質的在線監測，儀器體積大，不適合野外自動運行。湯冬雲等發明了一種水質綜合生物毒性在線監測自動分析儀器，設置有獨特的光電檢測單元，集成度高、結構小巧、便於移動，適用於野外測試，同時自動化程度高，能夠在線實時監測，無需人工值守，且檢測靈敏度高、準確度好。

4.6聯合技術應用

現有的技術中，進行生物毒性監測時，通常只使用單一生物傳感器，但不同的生物傳感器對不同汙染物的反應是不同的。例如，發光菌對金屬比較敏感，而對有機物不太敏感，魚類則相反，利用單一生物的反應來判斷水體汙染的情況，無法做到全面了解水汙染的狀況。因此，桂子榮等設計了一種基於魚類和發光菌的在線生物毒性監測儀，利用雙光路監測模塊同時監測水樣池和參比池的微生物螢光信號，並將螢光信號轉換成電信號傳遞至控制單元分析；利用行為監測器對試驗魚類的行為進行跟蹤拍攝，根據魚類群體活躍程度、魚群離散程度等群體參數變化對水體汙染情況進行監測。

5、總結與展望

國家對水環境質量監測越來越重視，基於發光細菌法的在線生物毒性監測方法從「十二五規劃」開始到「十三五」也取得了很好的進展。隨著生活水平的提高，現代社會對飲用水的水質要求也越來越高（從「合格水」轉變為「優質水」）。

（１）發光細菌毒性生物監測方法在水環境中有廣泛的應用，發光細菌菌種技術未來發展的方向：更穩定、更高靈敏度發光菌種的研究；菌種的凍幹製備技術的進一步發展。

（２）發光細菌在線生物毒性監測儀的發展方向：針對飲用水低毒的特點，發光細菌在線生物毒性監測儀應向更低檢出限發展；針對廢水水體的複雜性，在線生物毒性監測儀水樣分析預處理技術是研究的主要方向；多物種同時監測可以更好地提升數據的可信度和精密度，將發光細菌生物監測儀作為基礎，與其他物種監測儀共同開發聯合技術將是發展的一個方向。隨著其他生物傳感器（斑馬魚）等標準的實行，未來在線生物毒性監測儀的種類將更加豐富，監測方式也將更加立體。

拓展閱讀

王穎,廖誾彧,歐陽莎莉,等. 發光細菌在線監測水體汙染研究進展[J]. 淨水技術, 2020, 39(9):10-16.

WANG Y, LIAO Y Y,OUYANG S L, et al. Research progress of on-line monitoring technology of water pollution by using luminescent bacteria[J]. Water Purification Technology, 2020, 39(9):10-16.

作者：王穎,廖誾彧,歐陽莎莉,等。

編輯：李佳佳

排版：西貝

校對：王佳

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