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真核細胞前體mRNA需要經過複雜的加工過程才能成熟，進而行使其生物學功能。前體mRNA的加工過程包括：5』末端加帽，內含子與外顯子的剪接，以及3』末端加工。mRNA 3』末端的加工包括切割和多聚腺苷化兩個步驟 (cleavage and polyadenylation, C/P)：具有內切核酸酶活性的蛋白因子能夠識別前體mRNA 3』非翻譯區 (3』 untranslated region, 3』 UTR)中的多聚腺苷信號(poly(A) signal, PAS), 進而發生切割；隨後，多聚腺苷聚合酶(poly(A) polymerase, PAP)在切割位點後添加多聚腺苷尾 (poly(A) tail)。在哺乳動物細胞中，前體mRNA 3』末端加工機器的核心蛋白因子多達20多種，他們與RNA聚合酶II形成複合體，該複合體可進一步劃分為4種亞複合體，包括：切割和多聚腺苷酸化特異性因子、切割刺激因子、切割因子Ⅰ和切割因子Ⅱ；以及其他因子包括 poly(A)聚合酶、poly(A)結合蛋白等。前體mRNA 3』末端的切割和多聚腺苷化兩個步驟協同進行，作為重要的轉錄後修飾手段對前體mRNA的成熟，細胞核輸出以及後續生物學功能的實現至關重要【1】。
多聚腺苷信號(poly(A) signal, PAS)在前體mRNA中廣泛存在，選擇性切割和多聚腺苷化(alternative cleavage and polyadenylation, APA) 可產生具有不同長度3' UTR的mRNA異構體，還可以改變基因的編碼區。在過去的十幾年的研究中，我們已經了解到APA在細胞增殖，分化，腫瘤的發生等過程中扮演重要的角色；不同組織中mRNA異構體 3' UTR的長度具有顯著性差異 （例如：神經組織中mRNA異構體傾向於具有較長的3' UTR，而卵巢、睪丸、骨骼、肌肉等組織中mRNA異構體具有相對較短的3' UTR）；這一現象在果蠅，小鼠，以及人體中被廣泛發現，但調控該組織/細胞特異性APA的分子機制尚不清晰【2】。
近日，來自美國紀念斯隆-凱特琳癌症中心(MSKCC)的Eric Lai實驗室在Molecular Cell雜誌發表了文章Overlapping Activities of ELAV/Hu Family RNA Binding Proteins Specify the Extended Neuronal 3』 UTR Landscape in Drosophila, 該研究以果蠅神經系統為研究對象，發現了一類神經系統特異性RNA結合蛋白，ELAV/Hu家族蛋白，能夠調控果蠅神經系統中前體mRNA的選擇性切割和多聚腺苷化過程，作者提出了三種ELAV/Hu家族蛋白具有可以互相補充的調控組織特異性APA的活性。該研究首次確認了果蠅神經系統中調控APA的反式調節元件(trans-acting factors)，並進一步闡釋了ELAV/Hu家族蛋白調控神經系統APA的分子機制。
追溯到2012年，作者所在的Eric Lai實驗室在Cell Report上發表Global patterns of tissue-specific alternative polyadenylation in Drosophila首次系統地描述了果蠅中廣泛存在的組織特異性APA現象，提出神經系統中mRNA異構體具有較長的3『 UTR這一特徵【3】；隨後，利用該實驗室開發的mRNA 3』末端高通量測序技術，他們發現果蠅組織特異性APA現象在不同果蠅種系中具有高度的保守性【4】，但分子機制未知。ELAV/Hu家族RNA結合蛋白是一類神經特異性表達的RNA結合蛋白，該家族包括Elav蛋白及其同源的Rbp9蛋白和Fne蛋白。Elav蛋白(embryonic lethal abnormal vision)特異性地表達於果蠅神經細胞中，長久以來被作為神經細胞marker而廣泛使用；Elav蛋白對於果蠅早期胚胎發育，神經系統發育具有重要作用。Elav基因突變果蠅死於早期胚胎發育時期。Rbp9蛋白和Fne蛋白同樣也在神經系統中特異性表達(Rbp9蛋白在卵巢中也有一定水平的表達)，對於Rbp9蛋白和Fne蛋白功能的研究相對較少，因為其基因突變果蠅幾乎沒有明顯表型(某些Rbp9蛋白突變會造成雌性果蠅不育)。
2012年，UC Berkeley Michael Levine實驗室報導了Elav蛋白調控果蠅胚胎組織特異性APA的初步結果，確認了果蠅胚胎中APA過程單獨依賴於Elav蛋白的表達【5】。作者實驗室對這一結論持懷疑態度，首先，作者發現Elav基因突變果蠅並非立即死於胚胎時期，而是能夠發育至第一幼蟲階段(1st stage larvae, L1)。通過收集Elav基因突變果蠅晚期胚胎並使其繼續發育至第一幼蟲階段，手動去除卵殼，能夠得到存活的Elav基因突變型第一階段幼蟲，並解剖出其中樞神經系統(central neural system, CNS)。RT-qPCR 驗證一些基因的APA，作者驚訝地發現，雖然Elav蛋白並不表達，但是選取的基因仍舊錶達3』 UTR較長的mRNA異構體，這與2012年Michael Levine實驗室的結論不相符。作者提出假設，在Elav突變的情況下，其他ELAV/Hu家族成員可能存在補償效應，繼續調控神經系統中APA以表達3』 UTR較長的mRNA異構體。
接下來，利用gain-of-function體系，作者在果蠅晚期胚胎細胞系(非神經細胞系)中過表達單獨的ELAV/Hu家族RNA結合蛋白，發現每一種ELAV/Hu家族RNA結合蛋白都能夠獨立地調控APA，使細胞表達3』 UTR較長的mRNA異構體；通過mRNA 3『末端高通量測序技術發現，在非神經果蠅細胞系中過表達ELAV/Hu家族RNA結合蛋白會引起廣泛地APA調控使得細胞表達具有較長3』 UTR的mRNA異構體，其3』 UTR長度與果蠅神經細胞中檢測到的3』 UTR長度相符。這些結果從一個方面印證了Rbp9蛋白和Fne蛋白也具有和Elav蛋白相同的調控神經特異性APA的功能；在非神經細胞中過表達ELAV/Hu家族RNA結合蛋白，會調控非神經細胞具有神經細胞相似的轉錄組特徵。
令人好奇的是，果蠅神經系統在正常生理情況下，Elav蛋白主要表達在細胞核中，但Rbp9蛋白和Fne蛋白主要表達在細胞質中，APA發生在轉錄後修飾階段，前體mRNA仍存在於細胞核中，所以Rbp9蛋白和Fne蛋白基本不可能轉移到細胞核中調控APA。通過對Elav突變的第一階段幼蟲中樞神經系統的染色結果分析，作者發現當Elav蛋白由於突變不表達時，通常位於細胞質中的Fne蛋白轉移進入了細胞核 (圖1左)。這一重要發現為Fne蛋白能夠補償Elav蛋白缺失，進而調控神經系統APA提供了關鍵性證據。但是為什麼在Elav蛋白突變時，Fne蛋白會轉移到細胞核內呢？作者驚奇地發現，在Elav突變的第一階段幼蟲中樞神經系統中，fne轉錄本發生了選擇性內含子/外顯子剪接，一個未被注釋的45 bp微小外顯子被包括在新的fne轉錄本中，而這個微小外顯子在正常生理情況下是不被包括在fne轉錄本中的 (圖1右上)。該微小外顯子編碼15個胺基酸殘基，位於Fne蛋白結構中的J6-J7區域，而該區域恰好被報導參與調控蛋白定位與遷移。作者進一步驗證了在細胞水平，兩種Fne蛋白（包括與不包括這個微小外顯子編碼的15個胺基酸殘基）在細胞中的定位具有顯著差異：不包括該15個胺基酸的Fne蛋白嚴格地定位於細胞質中；而包括了15個胺基酸的Fne蛋白顯著性地定位於細胞核中 (圖1右下)。該實驗結果強有力地證明了當Elav蛋白突變後，fne轉錄本通過選擇性剪接編碼一個「新」的Fne蛋白，能夠轉移到細胞核中，代替Elav蛋白行使調控神經系統APA的功能。
圖1：Elav蛋白與Fne蛋白在野生型和Elav蛋白突變果蠅的第一幼蟲中樞神經系統的定位，以及Fne蛋白核轉移的分子機制。
利用loss-of-function體系，作者進一步研究了Elav蛋白與Fne蛋白雙突變果蠅，並發現該果蠅第一階段幼蟲中樞神經系統mRNA不再保有較長的3『 UTR。進一步證實了Fne對於Elav的補償效應。對於Rbp9，因其在果蠅第一階段幼蟲時期的表達量極低，作者猜測其並沒有過多地在該發育階段參與APA的調控。生物信息學研究表明，ELAV/Hu家族RNA結合蛋白偏好於結合3』 UTR中的U-rich區域，他們通過結合近端多聚腺苷信號(proximal PAS)下遊的U-rich區域，阻礙3』末端加工機器識別proximal PAS，進而指導RNA聚合酶II繼續轉錄生成較長的3『 UTR區域，最終識別遠端多聚腺苷信號(distal PAS), 使得神經系統中廣泛地表達具有較長3』 UTR的mRNA異構體。具有較長3』 UTR的mRNA異構體同時具有重要的生物學功能，對於保有神經可塑性，軸突樹突的神經活性具有重要的意義【6】。
與此同時，更進一步的研究正在進行，關於使用高通量測序技術系統性研究ELAV/Hu家族RNA結合蛋白在神經系統轉錄組中的結合位點；以及使用蛋白質組學的手段，探索ELAV/Hu家族RNA結合蛋白在不同細胞亞結構之間定位的變化所引起的蛋白-蛋白相互作用的差異。同時，將此研究結果延伸至哺乳動物細胞，探究哺乳動物中ELAV/Hu家族RNA結合蛋白對於神經系統APA的調控方式。
Eric Lai實驗室的博士後魏綠為該論文的第一作者，博士後Seungjae Lee為並列第一作者，進行了生物信息學分析，博士後Binglong Zhang進行了果蠅解剖和染色工作。Sonali Majumdar，Brian Joseph，Piero Sanfilippo，Pedro Miura進行了一部分早期工作，Matthias Soller提供了轉基因果蠅，Eric Lai為共同通訊作者。
https://doi.org/10.1016/j.molcel.2020.09.007
製版人：嘉
1. Elkon, R., Ugalde, A. P., & Agami, R. (2013). Alternative cleavage and polyadenylation: extent, regulation and function.Nature Reviews Genetics. 14(7), 496-506.
2. Gruber, A.J., and Zavolan, M. (2019). Alternative cleavage and polyadenylation in health and disease.Nat Reviews Genetics. 20, 599–614.
3. Smibert, P., Miura, P., Westholm, J.O., Shenker, S., May, G., Duff, M.O., Zhang, D., Eads, B.D., Carlson, J., Brown, J.B., et al. (2012). Global patterns of tissue-specific alternative polyadenylation in Drosophila.Cell Rep. 1, 277–289.
4. Sanfilippo, P., Wen, J., and Lai, E.C. (2017b). Landscape and evolution of tissue-specific alternative polyadenylation across Drosophila species.Genome Biol. 18, 229.
5. Hilgers, V., Lemke, S.B., and Levine, M. (2012). ELAV mediates 3』 UTR extension in the Drosophila nervous system.Genes Dev. 26, 2259–2264.
6. Garaulet, D.L., Zhang, B., Wei, L., Li, E., and Lai, E.C. (2020a). miRNAs and Neural Alternative Polyadenylation Specify the Virgin Behavioral State. Dev.Cell54, 410–423.e4.
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