Science |閆靖等開發新型抑制劑治療神經退行性疾病 ​

2020-10-27 BioArt

撰文 | Qi

責編 | 兮


N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartate receptors, NMDARs）是穀氨酸門控的鈣離子可滲透性神經遞質受體。它們是大腦發育的基礎，控制成年人的突觸可塑性，並且啟動整合神經系統適應性過程（例如記憶和獲得性神經保護）所需的轉錄應答【1】。然而，NMDAR也可能對神經元有害，因為它們同樣可以關閉（shut-off）存活相關基因的表達，導致線粒體功能障礙，從而引起由過量穀氨酸誘導的興奮性毒性細胞死亡【2-4】。NMDARs的這種雙刃劍（The NMDAR paradox）現象解釋了臨床試驗中旨在抑制NMDAR有害信號的拮抗劑的使用並沒有對神經元提供保護作用的原因。然而截至目前，毒性NMDAR信號的分子機制仍然未知。


2020年10月9日，來自德國海德堡大學的Hilmar Badin課題組（第一作者為閆靖博士）在Science雜誌上發表了一篇題為「Coupling of NMDA receptors and TRPM4 guides discovery of unconventional neuroprotectants」的文章，在這項研究中，作者證明興奮性毒性是由NMDAR與TRPM4在突觸外的物理偶聯所致，應用互作界面抑制劑可以破壞兩者的結合，從而緩解毒性並維持NMDAR正常生理功能。作者提出，重組或小分子NMDAR/TRPM4界面抑制劑的研發為保護神經元以及減輕當前無法治癒的人類神經退行性疾病症狀提供了機會。



首先，作者假設NMDAR信號的有害作用是由與其他蛋白質的特定相互作用引起的，並將候選蛋白的重點放在瞬時受體電位（transient receptor potential, TRP）通道家族的成員上。其中TRPM亞群曾被報導參與神經退行性變，且TRPM4被確認為NMDAR死亡信號複合體的關鍵組成部分【5】。作者通過使用重組腺相關病毒（rAAV）介導的TRPM4特異性shRNA的表達，敲低海馬神經元TRPM4，發現能夠顯著降低NMDA誘導的興奮性毒性。緊接著，NMDAR與TRPM4的物理偶聯在免疫共沉澱實驗中得到驗證：作為介導NMDAR興奮性毒性的亞基，GluN2A和GluN2B均在體外培養的神經元以及小鼠腦中存在與TRPM4的相互作用；相反，在TRPM4和GluN1亞基之間，以及與AMPA型穀氨酸受體亞基GluA2之間都沒有發現類似的相互作用。因此，作者認為GluN2A和GluN2B與TRPM4的特異性物理偶聯介導了NMDAR的毒性反應。


那麼，作者猜測是否可以通過破壞NMDAR/TRPM4複合體（N/T複合體）相互作用即可消除NMDAR介導的毒性呢？作者鑑定TRPM4的633-689位胺基酸所處的結構域（命名為TwinF），在兩種急性神經退行性疾病模型中提供了強大的神經保護功能。進一步地分析TwinF的結構特徵發現，TwinF包含多個α螺旋，並在其中心處形成帶有兩個苯丙氨酸Phe666和Phe667的袋狀結構，將Phe666和Phe667突變為丙氨酸（TwinF-F2A2），會導致TwinF失去針對NMDAR介導的毒性的神經保護作用；而將Phe666和Phe667突變為結構非常相似的酪氨酸（TwinF-F2Y2），則在很大程度上保留了TwinF的神經保護活性。免疫共沉澱實驗也再次證明，失活的TwinF-F2A2不能破壞N/T複合體，而具有功能的TwinF和TwinF-F2Y2則可以與內源性TRPM4競爭性的與NMDAR結合，從而破壞內源性N/T複合體並提供神經保護。


接下來作者想知道，GluN2A和GluN2B中的哪部分結構域負責與TRPM4的結合呢？作者通過對GluN2A和GluN2B的胺基酸序列比對分析，發現這兩個亞基在胞內域僅有少數重合。從而進一步通過實驗鑑定出一段含有18個胺基酸的肽段，除一個胺基酸有差異外其餘均相同。該區域包含四個規則間隔的異亮氨酸，且在鳥類和哺乳動物中高度保守（GluN2A的Phe861至Glu878；GluN2B的Phe862至Glu879），因此被稱為「I4」結構域，而GluN1，GluN2C，GluN2D和GluN3中沒有I4。將中央兩個異亮氨酸Ile868和Ile872突變為丙氨酸後，則會破壞它的功能。


值得注意的是，TwinF在體外和體內均具有強大的神經保護活性，這為將來的臨床應用帶來了希望。但就目前而言，將rAAV立體注射至大腦並不適用於人類，而通過口服或靜脈內施用小分子才是較為可行的治療方法。因此，作者進行了基於TwinF結構的計算藥物篩選，並從134萬個候選分子中篩選中192個潛在的小分子N/T界面抑制劑，進一步的實驗則確認並明確了化合物8和19的神經保護作用：（1）化合物8和19均可顯著降低GluN2A和GluN2B與TRPM4的結合以及NMDA誘導的海馬神經元細胞死亡，且作用效果與分子濃度存在正向線性關係；（2）化合物8和19可以阻止NMDA誘導的海馬神經元線粒體功能障礙；（3）化合物8即使在高濃度也不具備細胞毒性，而高濃度的化合物19則會損害神經元健康；（4）這兩種化合物不會阻斷NMDAR的電流和細胞內鈣信號；（5）化合物8對鈣離子激活的TRPM4通道活性沒有影響，而高濃度的化合物19可抑制TRPM4通道，這種差異可能是由這兩種小分子與TRPM4相互作用部位不同引起的；（6）解釋了化合物8和19可以消除NMDA誘導的轉錄因子CREB的阻斷途徑並恢復ERK1/2激活，從而減輕與NMDAR介導的毒性相關的轉錄失調。


圖1，破壞NMDAR / TRPM4相互作用的新型化合物 (圖片版權：Yan et al., Oct. 2020 Science/AAAS.)


最後，作者想知道小分子N/T互作界面抑制劑是否可以在動物體內提供神經保護作用。根據上述測試結果，最終選定化合物8來完成體內驗證。作者使用了兩種神經退行性疾病的小鼠模型：MCAO誘發的缺血性中風和玻璃體內注射NMDA誘發的視網膜神經節細胞 （RGC）變性。通過腹腔注射化合物8後2小時，GluN2A/TRPM4複合物形成減少26％，6小時減少36％；GluN2B/TRPM4複合物在2小時形成減少38％，而在6小時減少36％。最終，作者觀察到化合物8使MCAO中風模型中小鼠的大腦損傷顯著減少；此外，化合物8還強力的阻止了NMDA誘導的RGC死亡。該實驗證實在動物模型中，化合物8對興奮性毒性誘導的神經細胞損傷有強力的保護作用。


圖2，NMDAR / TRPM4作用界面抑制劑的神經保護模型 (圖片版權：Yan et al., Oct. 2020 Science/AAAS.)


總的來說，這項研究表明興奮性毒性是由於NMDAR與TRPM4的物理偶聯所致，這與當前「NMDAR過度活化和鈣超載」的觀點相反。因為神經突觸中沒有TRPM4分子的分布，因此N/T複合體是在突觸外形成的，這也這解決了長期存在的謎團，即根據其位置（突觸與突觸外）的不同，NMDAR可以分別促進神經元存活或死亡。此外，這項研究的結果證實可以通過重組蛋白TwinF或小分子N/T界面抑制劑去特異性的抑制毒性NMDAR的信號，同時保留NMDAR的關鍵生理功能。這種藥理作用方式提供了一種全新的治療原理，並不像傳統的NMDAR拮抗劑一樣損傷大腦的認知和記憶功能。TwinF和化合物8作為新型的N/T界面抑制劑，在治療目前無法治癒的人類神經退行性疾病，例如阿爾茲海默症、肌萎縮性脊髓側索硬化症等中具有巨大潛力。


原文連結：

https://science.sciencemag.org/content/370/6513/eaay3302



參考文獻


1.R. G. M. Morris, NMDA receptors and memory encoding. Neuropharmacology 74, 32–40 (2013). doi: 10.1016/ j .neuropharm.2013.04.014; pmid: 23628345

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3.S. A. Lipton, P. A. Rosenberg, Excitatory amino acids as a final common pathway for neurologic disorders. N. Engl. J. Med. 330, 613–622 (1994). doi: 10.1056/NEJM199403033300907; pmid: 7905600

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