通過RNA修復模板實現植物CRISPR精準編輯

2021-02-26 萊肯生物

對於利用CRISPR/Cas系統進行作物遺傳改良來說，以HDR方式實現優異等位基因替換和基因定點插入比基因敲除的需求更廣。但是修復模板的限制和雙鏈斷裂修複方式的偏好阻礙了這種技術手段的大規模應用。雖然已有多個研究成功實現了基因組的精準編輯（如單鹼基替換），然而效率依然很低。以往的修復模板主要以DNA的方式提供，若在植物中將RNA轉錄本作為DNA修復模板，則可通過利用合適的啟動子，通過體內轉錄，產生足夠多的修復模板，有望解決修復模板不足的問題。

最近，中國農業科學院作物科學研究所夏蘭琴與美國加州大學聖地牙哥分校趙雲德團隊證實，在植物細胞中RNA轉錄本可作為修復模板介導DNA同源重組修復。研究人員利用轉錄本RNA作為修復模板，藉助於核酶（Ribozyme）自切割和CRISPR/Cpf1系統既切割DNA又切割RNA的特性，通過HDR修複方式，成功實現了水稻乙醯乳酸合成酶基因（OsALS）的等位基因替換，建立了RNA轉錄本作為修復模板介導的DNA同源重組修復體系。

CRISPR/Cpf1系統具有DNA和RNA的雙重切割特性，因此可以在細胞核內同時加工產生用於靶向目標序列的crRNA和一起轉錄的RNA修復模板，既產生了DSB又提供了同源重組修復的RNA模板。研究人員將修復模板體外轉錄後，與LbCpf1蛋白與轉錄的crRNAs組裝為RNP複合體，並通過基因槍轉化水稻愈傷以對RNA修復模板進行測試，結果表明，RNA可以作為修復模板參與CRISPR/Cpf1介導的DNA同源重組修復。

此後，採用兩種方法構建同源重組載體：RDR和TDT。在RDR 方法中，將crRNA和DRT修復模板片段置於HH及HDV核酶之間，構成RCR（Ribozyme-crRNA-Ribozyme, RCR）和RDR（Ribozyme-DRT-Ribozyme, RDR）單元。將RCR1、RCR2和RDR置於OsU3啟動子與Nos終止子之間，在轉錄產物中，由於HH及HDV核酶的自切割作用，crRNAs和修復模板被完整釋放。在TDT方法中，修復模板兩側分別加上靶點序列，稱之為TDT (Target-DRT-Target)。將RCR1、RCR2和TDT置於OsU3啟動子與Nos終止子之間，Cpf1可對轉錄產物中TDT兩側的靶點序列進行切割，從而釋放RNA修復模板。通過基因槍轉化水稻愈傷，RDR及TDT載體均獲得ALS基因精確修飾的水稻植株，其中RDR載體效率約為1.7%，TDT載體效率為4.6%。通過水稻農桿菌轉化法，利用TDT載體，也獲得了OsALS基因部分同源重組的水稻植株。後代遺傳分析結果表明，替換後的OsALS基因後代遺傳符合孟德爾遺傳定律。

內容參考BioArt植物公眾號

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