Sci Adv | 腸道「暗物質」在體微生物行為研究新方法

人類生活與微生物密切相關，在自然界存在的細菌中，與人類關係最為密切的當屬定植在消化道中的微生物群。近十幾年來科學界對腸道菌群的研究呈爆發式增長，但整個領域的研究過於依賴於各類DNA測序手段，對於腸道細菌在體內的生長、代謝等微生物學過程知之甚少。只有對這些細菌的基礎行為有了深入理解，才能真正深究菌群在宿主生理和病理過程中發揮的各類複雜功能。然而，由於目前許多腸道細菌在實驗室中仍無法單獨培養，導致人們對這部分菌群的了解還相當匱乏，因此稱其為腸道中的「暗物質」。而那些能夠在實驗室中進行培養的腸道細菌，其在體外的研究結論能否完全反映其在體內的真實生物學行為，目前也仍存在一定爭議。因此，在腸道菌群研究領域中非常需要能夠直接在體探究腸道微生物活動的方法，以便了解其在體內原位的生長、代謝和繁殖情況。

9月4日，上海交通大學醫學院分子醫學研究院楊朝勇，王煒團隊在Science Advances在線發表了題為Revealing the in vivo growth and divisionpatterns of mouse gut bacteria 的研究論文，利用D-型胺基酸在體序貫標記技術，結合使用螢光原位雜交（fluorescence in situ hybridization, FISH）探針，研究小鼠腸道中的各類細菌在體內的生長分裂方式，為揭開這些腸道「暗物質」的神秘面紗提供了首個可行的研究方法。

細菌細胞壁上的肽聚糖（peptidoglycan）在合成和代謝過程中，會通過青黴素結合蛋白（penicillin binding protein, PBP）的轉肽酶結構域在其五肽結構末端的D-型胺基酸（D-amino acid, DAA）處發生替換（與周圍環境中的其他DAA）、水解（去掉最末端的D-丙氨酸）等修飾，並且細菌的某些PBP對DAA的側鏈上的基團有很高的容忍性。因而，如果在細菌生長環境中加入帶有螢光基團的fluorescent DAA（FDAA）探針，在其細胞壁的代謝過程中探針就可以被共價地連接到肽聚糖的寡肽結構中。由於絕大部分種類的細菌都存在較為保守的肽聚糖結構，因而在灌胃使用後，FDAA探針可以通過小鼠腸道細菌本身的生長代謝過程，實現對大多數腸道菌群的螢光標記。在此項工作中，研究人員序貫使用帶有不同顏色的FDAA探針（TADA, Cy5ADA）灌胃，對小鼠的腸道菌群進行在體標記，以此使得絕大部分腸道細菌會同時帶有兩種螢光的標記信號。由於新合成的細胞壁區域會帶有較強的第二探針信號，因此兩種螢光在細胞壁上的分布可以反映細菌在標記過程中的生長分裂情況。隨後，將盲腸的菌群樣品分別使用靶向染色特定種屬細菌的FISH探針，即可通過螢光成像明確各種細菌相應的生長分裂模式（圖1），這其中也包括了尚無法在體外進行單獨培養和研究的腸道細菌。

圖1 FDAA序貫標記結合FISH染色示意圖及腸道菌群雙色螢光標記成像

研究者分別觀察了小鼠腸道內6種革蘭氏陽性和6種革蘭氏陰性菌屬（genus）在體原位的生長分裂模式。並在此基礎上，設計靶向特定細菌物種（species）的FISH探針，在種水平上觀察不同細菌在體內的生長分裂情況，其中明確了6種不可培養細菌的分裂模式。此外，該團隊還成像觀察到分節絲狀菌（SegmentEdfilamentous bacteria, SFB）這一重要的免疫相關的腸道細菌在體內的生長分裂情況，利用雙色螢光成像提供的微生物學信息，可以分析SFB細菌成熟分化過程的不同階段，為研究SFB在體內的微生物活動提供了新的策略。

圖2 FDAA序貫標記的SFB雙色螢光成像圖

此外，近期該團隊還開發了可對腸道細菌在體的生長代謝活性進行直接定量的新方法。研究人員首先證明了FDAA的標記強度能夠準確地反映細菌的生長代謝水平。通過灌胃FDAA在體標記各類腸道細菌後，結合FISH探針靶向菌群中感興趣的特定種屬，進而可利用流式細胞術分析該類細菌的FDAA螢光強度，從而對其在體的生長代謝水平進行直接定量。該團隊將這一定量方法用於腸道菌群代謝活性的晝夜節律研究，發現小鼠腸道中革蘭氏陽性菌在夜間生長代謝活躍，而革蘭氏陰性菌則恰好相反，為理解菌群在體內的微生物活動規律提供了新的見解。該工作於2020年5月發表在德國應用化學 (Angew.Chem. Int. Ed. 59: 11923) 。

綜合上述兩個工作，該研究團隊基於FDAA代謝標記與FISH染色，開發了可定性研究各類腸道細菌在體原位生長分裂方式的新策略，並可利用這一原理對腸道細菌在體原位的生長代謝水平進行直接定量，成功建立了一套獨立於DNA測序之外的腸道細菌在體研究的新穎方法，為揭開腸道「暗物質」的秘密提供了新工具。

值得一提的是，近年來該研究團隊利用其開發的FDAA在體代謝標記這一策略發展了多種腸道菌群研究的新策略。在19年發表的一項工作中（Nat. Commun. 10: 1317），該團隊與北京大學陳興教授團隊合作，應用FDAA序貫標記，提出了首個可用於研究糞菌移植（Fecal microbiota transplantation，FMT）後植入菌存活情況的非測序方法。研究者利用FDAA探針代謝標記供體小鼠的腸道菌群，在移植給受體小鼠後，利用帶有第二種顏色的FDAA探針灌胃標記受體小鼠總體的腸道菌群，以此能夠通過細菌上兩種螢光信號的標記分布情況來判斷植入菌在受體內的存活情況（存活下來的植入菌應當同時帶有兩種顏色的FDAA標記）。此外，該研究團隊與交大醫學院譚蔚泓教授團隊合作，基於FDAA代謝標記策略，結合使用近紅外二區（NIR-II）染料，首次實現了腸道菌群的實時活體成像（Angew. Chem. Int. Ed. 59：2628），為可視化觀察體內深層組織中的各類細菌提供了一個便捷的研究工具。