4 月 28 日，哈爾濱工業大學生命學院黃志偉教授課題組在《自然》（《Nature》）在線發表了題目為《Anti-CRISPR 蛋白抑制 CRISPR-SpyCas9 活性的分子機制》（Structural basis of CRISPR-SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein）的研究論文。
CRISPR-Cas 系統是細菌編碼的用來保護
細菌免受噬菌體感染的適應性免疫系統，該系統通過 crRNA 引導的 Cas 核酸酶剪切入侵病毒的 DNA 或者 RNA 從而防禦病毒感染。由於 CRISPR-Cas 系統與 sgRNA 組合具備高效、便捷「編輯」目的 DNA 的能力，CRISPR II- A 亞型系統之一的鏈球菌 Cas9（SpyCas9）系統已被廣泛應用於全世界範圍內的生物醫學研究以及
基因治療領域，進行細胞、組織或個體內 DNA 的敲除、激活、修飾、突變等，而且該系統已經成為目前最重要的、也是最廣泛使用的基因編輯工具。
但是，如何減少 SpyCas9 過度激活或者長時間活性帶來的基因編輯脫靶效應，以及如何對 SpyCas9 的活性進行時間、空間或條件性的精確控制，是當下 SpyCas9 系統用於細胞或組織基因編輯、
基因治療等亟需解決的重要並具挑戰性的科學問題。早先的研究發現一類來自於 Listeria monocytogenes 前噬菌體的 Anti-CRISPR 基因 AcrIIA4 等在細胞內能夠抑制 SpyCas9 的基因編輯活性，然而這些 Anti-CRISPR 基因抑制 SpyCas9 活性的分子機制並不清楚。
為了研究 AcrIIA2 或 AcrIIA4 是否能夠直接結合 SpyCas9，課題組首先建立體外生物化學研究系統，研究發現 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA2 或 AcrIIA4 直接結合 SpyCas9-sgRNA 複合物，有趣的是 AcrIIA2 或 AcrIIA4 只和結合有 sgRNA 的 SpyCas9 有相互作用，而和單獨 SpyCas9 並沒有相互作用；進一步實驗發現 AcrIIA2 或 AcrIIA4 能夠直接抑制 SpyCas9 介導的目的 DNA 的剪切。
為了研究 AcrIIA4 直接抑制 SpyCas9 活性的分子機制，課題組純化出 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 複合物，並通過結構生物學研究方法解析了 SpyCas9-sgRNA-AcrIIA4 複合物的晶體結構，該複合物結構揭示 AcrIIA4 蛋白構象是一個新的摺疊，它結合在 SpyCas9 的 CTD、TOPO 和 RuvC 三個結構域形成的凹槽區域。該凹槽區域正是 SpyCas9 上的底物 PAM DNA 的結合位點；另外來自 AcrIIA4 的β1 摺疊片前的 Loop 與 RuvC 活性位點接觸也加強了 AcrIIA4 對 SpyCas9 的抑制作用。上述結構觀察結果顯示 AcrIIA4 和底物 PAM DNA 競爭性結合 SpyCas9，AcrIIA4 比底物 PAM DNA 具有更強的親和力的實驗結果進一步支持了結構觀察的結果。接下來的生化實驗結果進一步證實 AcrIIA4 結合 SpyCas9 後抑制底物 PAM DNA 結合 SpyCas9，從而拮抗 SpyCas9 的活性。
非常顯著的是，AcrIIA4 的酸性胺基酸 Asp14、Asp37、Glu40、Asp69 和 Glu70 的位置完全與結合 SpyCas9 的底物 PAM DNA 的磷酸主鏈位置一致，而且上述 AcrIIA4 的胺基酸直接和 SpyCas9 PI 結構域上的 PAM DNA 識別胺基酸 Glu1108、Ser1109、Ser1216、Lys1200、Arg1335 和 Arg1333 互作。這些結構觀察結果揭示 AcrIIA4 通過模擬 PAM DNA 結合 SpyCas9。SpyCas9 蛋白的 AcrIIA4 結合胺基酸在同亞型 N. meningitidis Cas9 (NmeCas9) 中保守，而在不同亞型 II-C Listeria monocytogenes Cas9 (LmoCas9) 中並不保守，從而很好地解釋了 AcrIIA4 為什麼能抑制 LmoCas9 的活性，卻不能抑制 NmeCas9 的活性。
課題組通過進一步結構比較、分析發現，單獨 SpyCas9 上並不存在 AcrIIA4 的結合位點，SpyCas9-sgRNA 複合物的形成，使得 SpyCas9 構象發生顯著變化，組裝形成 AcrIIA4 結合位點，從而很好地解釋了本項目初始生化研究結果顯示的 AcrIIA4 只結合 SpyCas9-sgRNA 複合物，而不結合單獨 SpyCas9。該結果也和細菌細胞內單獨 SpyCas9 是瞬時存在的，而 SpyCas9-sgRNA 複合物是主要存在形式相一致。SpyCas9-sgRNA 複合物形成時，也是噬菌體被細菌 CRISPR 免疫系統「發現」並將被「幹擾」之時，因此，這個階段（SpyCas9-sgRNA 複合物期）是噬菌體抑制
細菌的適應性免疫系統（CRISPR-Cas9）的最合適時期。
該研究揭示的 Anti-CRISPR 蛋白 AcrIIA4 抑制 SpyCas9 活性的分子機制，不僅對揭示
細菌免疫系統（CRISPR-Cas9）與噬菌體防禦系統（Anti-CRISPR）「軍備競賽」的共進化分子機制具有重要的科學意義，而且為設計時間、空間特異性地，或條件性地精確控制 SpyCas9 基因編輯活性的工具提供了結構基礎。該成果是黃志偉團隊繼 CRISPR-Cpf1（Nature，2016；RNA Biology，2017）、CRISPR-C2c1(Cell Research，2017) 等研究成果之後，在病原與宿主相互作用和基因編輯分子機制研究領域取得的又一重要研究成果。
黃志偉教授為本研究論文的通訊作者，該團隊的博士研究生董德、郭明慧和碩士研究生王思涵 3 位同學為該論文的並列第一作者。該團隊的師資博士後朱玉威、碩士生王碩、熊智、楊建增、本科生徐增亮參與部分研究工作。全部研究工作在哈工大完成。上海同步輻射中心為晶體數據收集提供了支持。本項目受到國家自然科學基金委、哈工大青年科學家工作室等基金的資助。（
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原文出處;
De Dong et al.Structural basis of CRISPR–SpyCas9 inhibition by an anti-CRISPR protein，Nature (2017).DOI：10.1038/nature22377