2020年10月，中國科學院生物物理研究所蛋白質與多肽藥物重點實驗室梁偉研究員團隊在Cell Reports (IF=8.109)發表外泌體相關研究，揭示了腫瘤來源的外泌體（TDEs）作為脂肪酸載體，誘導代謝向氧化磷酸化轉變，導致樹突狀細胞（DCs）免疫功能障礙，並提示PPARα可能是一個潛在的免疫治療靶點。
下面我們就來感受一下這項研究的獨到之處吧！
中文題目：PPARα抑制克服腫瘤源性外泌體脂質誘導的樹突狀細胞功能障礙
期 刊：Cell Reports
影響因子：8.109
樹突狀細胞（DCs）是專業的抗原呈遞細胞，在協調針對病原體感染或腫瘤發展的免疫反應中起關鍵作用。然而在腫瘤微環境（TME）中有很多免疫抑制因子破壞DCs的功能，主要是抑制DCs的成熟和抗原呈遞能力，以及增加免疫檢查點蛋白的表達，誘導產生免疫功能失調的TIDCs。外泌體作為細胞分泌的微小囊泡，可以攜帶多種信號分子（如核酸、蛋白質和脂類等），是細胞間通信的重要媒介。本文證實腫瘤來源的外泌體（TDEs）可攜帶脂肪酸，通過PPARα的響應，誘導DCs功能失調、促進免疫逃避。
先前報導觀察到，TIDCs具有脂質蓄積，並存在引發細胞毒性CD8+ T細胞能力缺陷的特徵。此外，在體外與腫瘤細胞或腫瘤培養基（TCM）共培養的骨髓源性DCs（BMDCs）中也能形成脂滴（LD）。這些結果提示，腫瘤來源的因子可能誘導TIDCs脂滴累積。
1.2 TDEs誘導BMDCs的脂質累積
從TCM中分離腫瘤外泌體（TDEs），利用透射電鏡（TEM）觀察外泌體的大小和形態，利用WB分析外泌體標記蛋白（ALIX、HSP70、TSG101、CD9和CD81）的表達。單獨摻入外泌體增加了BMDCs的細胞內脂質，而不含外泌體的細胞培養基組分沒有這個功能。
1.3 攝入TDEs的TIDCs具有脂質累積和免疫功能障礙的性質
構建GFP-CD9腫瘤細胞（TC-1和MC38），這些細胞能分泌帶GFP標記的外泌體，可以在活體內追蹤TDEs。
結果顯示，只有捕獲GFP標記（GFP+）TDEs的TIDCs具有豐富的脂質和免疫功能障礙，而GFP- TIDCs則沒有這個作用。將純化PKH67標記的TDEs注射到野生型（WT）C57BL/6小鼠足部，與遠離足墊的淋巴結相比，足墊附近淋巴結的DCs吞噬更多TDEs，堆積更多脂質，對CD8+ T細胞的啟動能力較弱。
以上表明，TDEs對於促進TIDCs的脂質積累至關重要。
圖1：腫瘤來源的TDEs促進DCs的脂質積累
2.1 TED-BMDCs能夠上調免疫檢查點蛋白和免疫抑制因子，降低抗原呈遞能力
經TDEs處理的BMDCs數據分析表明，TDEs顯著上調了抑制性檢查點蛋白PD-L1和SIRPα等的表達，並增加了免疫抑制因子TGF-β的分泌。使用25-d1.16抗體檢測BMDCs表達抗原的能力，經TDEs處理的BMDCs呈遞抗原的能力都較弱，誘導腫瘤細胞增殖，並促進OTI CD8 + T細胞中幹擾素-γ（IFN-γ）的產生。
2.2 GW4869能夠部分回復TDE-BMDCs的功能
將BMDCs與經過或未經GW4869（一種減少外泌體分泌的nSMase抑制劑）處理的TCM共孵育。脂質水平和CFSE稀釋試驗證實，GW4869處理的TCM可以部分緩解DCs脂質積累及T細胞啟動能力缺陷。這表明TDEs誘導了DCs免疫功能障礙。
圖2：TDEs可介導DCs功能障礙
3.1 TDEs中的FAs參與調控DCs的脂質累積
流式細胞術分析：BMDCs攝取TDEs後，即出現了時間和濃度依賴性的脂質積累；
脂質組學分析：與非癌細胞來源的外泌體（NEs）相比，TDEs含有豐富種類的脂肪酸（FAs），TDEs中富集的FAs都相應在TDEs處理的BMDCs中富集。
結果表明，來自TDEs而不是NEs的FAs，導致了DCs的細胞內脂質積累。
3.2 直接攝取TDE-FAs是DCs功能失常的原因
合成甘油三酯所需的FAs有兩個來源：外源性FAs（來自TDEs的FAs）和內源性合成FAs。數據表明，脂質在TDEs處理的DCs中的積累是攝取TDEs衍生FAs的結果，而不是TDEs誘導的從頭合成FAs。TDEs中包含的FAs直接造成DCs中的脂質蓄積和免疫功能障礙。
圖3：TDEs衍生的FAs誘導DCs內脂質積累
TDEs-FAs激活PPARα抑制DCs免疫激活能力
4.1 RNA-seq確定PPARα參與TDE-DCs的功能失常
基於美吉雲平臺(http://cloud.majorbio.com)的轉錄組學測序分析，設置TDEs處理DCs組、NEs處理DCs組和空白對照（CTR）組DCs。
基因通路分析：聚焦於代謝通路，經TDEs處理的DCs與經CTR組相比，高表達脂質代謝相關基因。基因富集的通路，如脂質儲存和FAs代謝，與PPARs相關。TDEs處理後的DCs中，參與LD生成和FAO的PPARα及其下遊基因如Ppargc1a、Acsls、Cpts和Dgat2表達上調，而PPARγ的表達下調。
4.2 抑制PPARα能夠消除TDE-DCs的功能失常效果
Bodipy 473/503染色：PPARα抑制劑GW6471顯著降低了TDEs誘導的脂質積累，消除了TDEs介導的對BMDCs的抑制作用，從而增強了T細胞產生IFN-γ的能力；而PPARδ抑制劑GSK3787則沒有這個效果。此外，抑制PPARα降低了TDEs誘導的Tregs。
數據表明，PPARα在TDEs誘導的DCs免疫功能紊亂中發揮了核心調控作用。
圖4：TDEs介導的PPARα激活引發DCs脂質積累和功能障礙
PPARα介導FAO是調控DCs功能障礙的關鍵通路
5.1 TDEs通過PPARα將DCs從糖酵解代謝轉化成OXPHOS狀態
TDEs處理的BMDCs的基礎OCR和最大OCR 都顯著增加，表明氧化磷酸化（OXPHOS）顯著增強，TDEs降低了糖酵解的速率；GW6471對PPARα的抑制回復了這些變化。這些表明TDEs以PPARα依賴方式將DCs的代謝從糖酵解狀態轉變為OXPHOS。
5.2 阻斷FAs代謝能夠回復TDE-DCs的免疫功能障礙
PPARα調控FAs代謝有兩條途徑：通過Acsl催化FAs形成醯基CoA，產生LD；或者通過Cpt1，將FAs轉運到線粒體中進行β-氧化。
單獨使用特異性拮抗劑抑制Acsl或Cpt1可以部分恢復DCs功能，而同時阻斷這兩條通路則會減輕TDEs處理DCs的免疫功能障礙，與GW6471結果一致。
圖5：PPARα的激活可重組DCs的脂質代謝
6.1 活體驗證阻斷PPARα後能夠發揮抗腫瘤效果
體外功能測定與之前在BMDCs中的結果一致，PPARα抑制劑GW6471處理後降低了TIDCs的細胞內脂質積累，恢復了TIDCs啟動T細胞的功能。
PPARα基因敲除（KO）小鼠驗證：PPARα缺陷導致TIDCs脂質含量下降，抗原特異性tet+ CD8+ T細胞比例升高，CD8+ T細胞功能改善。且PPARα−/−小鼠的腫瘤生長速度比WT小鼠慢。
6.2 PPARα抑制劑聯合PD-L1阻斷可啟動更強的抗腫瘤效果
評估了使用GW6471和抗PD-L1抗體的聯合治療，與單藥治療方案相比，該聯合治療方案能夠減低MC38-OTI建立的腫瘤，且提高了無瘤小鼠的比例，並顯著延長了小鼠的壽命。
6.3 PPARα抑制聯合免疫疫苗治療，可以增強免疫治療效果
作者開發了一種納米尺度的E7相關肽包裹疫苗，用於治療宮頸癌（TC-1），並含有來自人乳頭瘤病毒（HPV）的E7抗原。用GW6471治療TC建立的腫瘤可以顯著提高E7疫苗的抗腫瘤效果。在免疫原性較低的B16/F10黑色素瘤模型中，PPARα抑制也增強了PD-1抗體的抗腫瘤效果。
圖6：PPARα抑制可增強免疫治療的抗腫瘤效果
在CD11c-白喉毒素受體（CD11c-DTR）嵌合小鼠（該小鼠在DT作用下消除CD11c+ DCs）中注射MC38-OTI腫瘤。隨著DCs的減少，腫瘤對聯合治療沒有反應。在MC38-OTI腫瘤模型中，PPARα−/− DCs疫苗與WT DCs疫苗相比具有更好的抗腫瘤效果。
這些數據共同證明了TDEs通過激活PPARα信號，導致DCs免疫功能障礙。用特異性抑制劑阻斷PPARα信號通路可恢復DCs功能，改善抗腫瘤免疫治療。研究結果提示，靶向PPARα可逆轉DCs的免疫功能失調狀態，是提高抗腫瘤免疫治療的一種有效策略。
圖7：DCs中的PPARα是抗腫瘤免疫所必需的
① 腫瘤來源的外泌體（TDEs）導致DCs功能障礙；
② TDEs衍生的脂肪酸激活PPARα，誘導DCs脂肪酸氧化；
③ PPARα和抗脂質體阻斷劑可調節DCs脂質代謝與功能；
④ 抑制PPARα可增強免疫治療的抗腫瘤效果。
TDEs作為FAs的載體，直接增加了細胞質脂質水平，開啟了代謝轉換PPARα，以誘導LD積累和FAO，並最終抑制了TIDCs的T細胞啟動能力。此外，該研究結果提供了一種有前途的免疫療法組合策略，可通過恢復TIDCs的功能來最大化腫瘤特異性CD8+ T細胞的誘導、擴增和細胞毒性。這樣，靶向PPARα可以被用來改善基於DCs的癌症治療。
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參考文獻：
Yin, X., Zeng, W., Wu, B., et al. (2020) PPARα Inhibition Overcomes Tumor-Derived Exosomal Lipid-Induced Dendritic Cell Dysfunction [J]. Cell Reports, https://doi.org/10.1016/j.celrep. 2020.108278.