三篇Cell | 訓練免疫與抗腫瘤免疫反應和病原體感染

撰文 | 靜雪、雪月

責編 | 小飛飛

隨著對腫瘤免疫在癌症中重要作用的認知加深，科學家們開發了多種多樣的免疫治療策略。髓系譜系細胞是腫瘤微環境中免疫細胞浸潤的主要成分，然而，當前的免疫療法主要針對適應性免疫。儘管，腫瘤及其微環境通常將髓系細胞的表型改變為促進腫瘤生長的表型。但先天免疫細胞也確實具有發揮抗腫瘤活性的潛力。因此，將先天免疫細胞的促腫瘤表型逆轉為抗腫瘤表型的免疫療法，代表了一種有力的新型抗腫瘤方法，可以與目前針對適應性免疫的免疫療法協同作用，發揮更強勁的抗腫瘤免疫作用。

真菌來源的多糖 β-葡聚糖或卡介苗（BCG）可促進髓系細胞對繼發感染或炎症產生持續增強的反應，這個過程被稱為「訓練先天免疫」或「先天免疫記憶」，這一過程通過轉錄組，表觀遺傳和代謝重編程實現。最新研究報導「訓練」免疫的激動劑具有抗腫瘤活性。例如，β-葡聚糖與腫瘤免疫治療功效有關。但是，「訓練免疫」激動劑在腫瘤中發揮作用的分子機制仍然是未解之謎。更重要的是，像 β-葡聚糖這樣的藥物所發揮的潛在腫瘤調節作用，是否涉及誘導「先天免疫記憶」迄今為止尚未得到解決。

2020年10月29日，來自德勒斯登工業大學的Triantafyllos Chavakis教授團隊在Cell雜誌上發表了名為Innate Immune Training of Granulopoiesis Promotes Anti-tumor Activity的文章，作者發現並確定了一種由 β-葡聚糖誘導的、具有腫瘤治療潛力的、涉及粒系生成和中性粒細胞表觀遺傳改變的「訓練先天免疫」。

作者首先通過小鼠腫瘤模型發現 β-葡聚糖誘導的「訓練免疫」能夠顯著抑制腫瘤的生長，並且，這一特殊的抗腫瘤作用並不依賴適應性免疫。

那麼，β-葡聚糖誘導的抗腫瘤作用的機理是什麼呢？作者利用RNA-Seq來分析β-葡聚糖預處理的腫瘤相關中性粒細胞 (TANs) 和腫瘤相關單核細胞。結果發現：來自β-葡聚糖「訓練」小鼠的TAN的轉錄組譜發生了變化。其中，β-葡聚糖「訓練」小鼠的TANs與TAN1的抗腫瘤特徵顯著正相關。與吞噬作用有關因子的基因表達以及抗原遞呈相關基因的表達在β-葡聚糖「訓練」小鼠的TANs中均得到增強，這也與抗腫瘤作用相關。作者還發現，β-葡聚糖處理可以增強TANs中ROS水平，而ROS產生是「訓練」的中性粒細胞發揮抗腫瘤活性的基本特徵。以上結果均表明，「訓練免疫」可誘導TANs的抗腫瘤表型。

隨後作者發現，β-葡聚糖誘導的「訓練先天免疫」可以長期維持。值得注意的是，β-葡聚糖誘導的訓練免疫的腫瘤抑制特性可以通過骨髓移植到未經訓練的小鼠身上。作者還發現 β-葡聚糖誘導的「訓練」免疫所發揮的抗腫瘤作用是通過「訓練」骨髓祖細胞來引發的，而不是對嗜中性粒細胞本身的直接調節來介導的，因此需要足夠的誘導時間來實現。這就說明，粒系祖細胞是「訓練免疫」的靶標，可導致誘導中性粒細胞發揮增強的抗腫瘤活性。

對骨髓細胞、GMP細胞（粒系-單核祖細胞）的轉錄組學分析和單細胞表觀基因組分析發現，β-葡聚糖誘導的「訓練免疫」與粒系生成過程中增強的IFN信號傳導相關。更進一步，作者發現，在癌症環境下，細胞對I型IFN的內在反應對「訓練」的粒細胞生成是至關重要。

鑑於「訓練」免疫具有的預防腫瘤發展的作用，作者想進一步探索「訓練」免疫是否具有腫瘤治療潛力。最後實驗發現，β-葡聚糖「訓練」的中性粒細胞能夠直接治療正在生成的腫瘤，從而建立了「訓練」免疫的腫瘤治療潛力。

綜上，作者發現β-葡聚糖誘導的「訓練先天免疫」具有抗腫瘤作用。這種「訓練先天免疫」的抗腫瘤作用與粒細胞生成的轉錄組和表觀遺傳的重排相關，同時和中性粒細胞向抗腫瘤表型的重編程相關；該過程需要I型IFN信號傳導，而與宿主的適應性免疫無關。並且，這種「訓練」的粒細胞生成的抗腫瘤作用可通過骨髓移植給未接受過治療的小鼠。

「訓練免疫」通過誘導骨髓祖細胞的訓練特性來調節和維持。儘管可以輕易地通過一系列「訓練劑」來誘導培養的髓系細胞的「訓練免疫」，但是全身誘導需要骨髓祖細胞的參與。為此，可以對納米材料進行功能化修飾，使其具有誘導「訓練免疫」的分子結構，並通過設計使其具有較高的骨髓親和力，以便促進其與骨髓祖細胞的結合，誘導「訓練免疫」。如果設計適當，此類納米材料可以通過刺激誘導「訓練」的髓系細胞來引發持久的抗癌先天免疫反應。

第二篇Cell文章來自西奈山伊坎醫學院和埃因霍溫科技大學的Willem J.M. Mulder教授團隊，題目為Trained Immunity-Promoting Nanobiologic Therapy Suppresses Tumor Growth and Potentiates Checkpoint Inhibition，作者開發了一種新的骨髓靶向納米生物系統，該系統能夠誘發「訓練免疫」，可以抑制腫瘤生長並增強免疫檢查點抑制的治療效果。

作者首先創建了一個包含納米生物製劑的MDP/MTP-HDL小型文庫。由人載脂蛋白aopA1和磷脂1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷脂醯膽鹼（DMPC）組成，摻入了不同摩爾量的L18-MDP或MTP-PE（1.0-10 mol％）。除此之外，作者加入了膽固醇（5-20%）來增加納米生物製劑的穩定性。最終，經過篩選確定了一個主要候選藥物，名為MTP10-HDL。MTP10-HDL經過靜脈注射給荷瘤小鼠後，能夠循環24小時，能夠被造血幹細胞和多能祖細胞攝取（圖1）。體外「訓練免疫」測定，體內生物分布以及毒性實驗表明MTP10-HDL具有開展免疫治療研究的良好特徵。

圖1. MTP10-HDL的體內生物分布。

作者首先證實MTP10-HDL具有良好的抗腫瘤活性。同時通過骨髓過繼轉移實驗，作者也證明骨髓對MTP10-HDL納米免疫療法抗腫瘤的重要貢獻。

那麼，MTP10-HDL是如何發揮抗腫瘤作用的呢？作者利用18F-脫氧葡萄糖-PET成像發現，MTP10-HDL處理能夠明顯促進小鼠骨髓的代謝活性。通過易位轉座酶染色質測序發現，MTP10-HDL的處理引發了免疫系統的表觀遺傳變化。RNA測序結果也表明，MTP10-HDL處理可導致轉錄水平的明顯變化。隨後，作者證實MTP10-HDL通過體內骨髓祖細胞，增強骨髓細胞增殖和新陳代謝來抑制腫瘤生長。總之，MTP10-HDL處理可導致較高數量的髓樣細胞，以及應對異源刺激增強的細胞因子反應，這是與誘導「訓練免疫」相關的表型。

然後作者發現，骨髓細胞的活化對抗腫瘤作用至關重要，但最佳的治療活性需要與適應性免疫細胞的結合。作者還證實了MTP10-HDL調節免疫抑制腫瘤微環境以及加強檢查點抑制療法的能力。結果發現，相比於抗PD-1單藥治療組，抗PD-1療法與MTP10-HDL的組合療法具有顯著增強的腫瘤抑制能力。此外，作者沒有觀察到抗CTLA-4單一療法的抗腫瘤作用，但當其與MTP10-HDL聯用時顯著抑制了腫瘤的生長速度。最有趣的是，抗PD-1 +抗CTLA-4治療未顯示任何抗腫瘤作用，但將其與MTP10-HDL組合可強烈抑制腫瘤生長。以上結果表明，MTP10-HDL治療可增強免疫系統對免疫檢查點抑制療法的敏感性。

作者利用多色流式發現，MTP10-HDL免疫療法可以顯著增加骨髓、脾臟和血液中的髓系細胞的組成，這與HSCs細胞和髓系偏向祖細胞的活化一致。同時MTP10-HDL治療降低了腫瘤微環境中腫瘤相關巨噬細胞 (TAMs) 的比例，這可能與MTP10-HDL治療可增強免疫系統對免疫檢查點抑制療法的敏感性的結果相一致。

最後，作者在非人類靈長類動物獼猴中利用PET成像發現，MTP10-HDL注射後，顯示出快速的骨髓和脾臟積聚，以及肝臟吸收。在48小時注射後，未觀察到主要器官（如大腦等）對MTP10-HDL的攝取。同時，作者發現，MTP10-HDL治療耐受性良好。總的來說，MTP10-HDL的毒性和生物分布概況在小鼠和非人類靈長類動物中非常相似，表明作者的納米生物學免疫療法具有轉化潛力。

綜上，作者開發了骨髓靶向的納米生物學平臺，專門設計用於誘導「訓練免疫」。作者建立了候選MTP10-HDL納米製劑的強大抗腫瘤能力。這一抗腫瘤作用源於「訓練免疫」誘導的骨髓生成，主要由骨髓中多能祖細胞的表觀遺傳重排引起，並克服了免疫抑制性腫瘤微環境。此外，採用MTP10-HDL納米療法克服了黑素瘤對抗PD-1和抗CTLA-4治療的耐藥性。最後，作者確定了MTP10-HDL的良好生物分布，以及其在非人類靈長類動物體內的安全性。總之，作者證明了經過合理設計的納米生物製劑，可以通過單一療法或與免疫檢查點抑制劑療法聯合來促進「訓練免疫」並引發持久的抗腫瘤反應。

機體受到感染或者應激期間，骨髓中的造血幹細胞（hematopoietic stem cells）會打破休眠狀態，通過擴增並分化為特定譜系的祖細胞，以適應外周對免疫細胞的需求。該過程受到嚴格調控，避免HSC活化紊亂，損害機體免疫系統穩態。2018年，加拿大McGill大學Maziar Divangahi課題組發表文章表明病原體感染會導致造血幹細胞特異性的細胞分化譜系。他們發現卡介苗(Bacille Calmette-Guérin, BCG) 或者β-葡聚糖會導致骨髓細胞重編程，以IFN-II和IL-1依賴的方式促進其向抗結核桿菌方向發展。

Maziar Divangahi團隊發現訓練免疫受到HSC表觀遺傳驅動的，表觀遺傳信息可以傳遞給BM來源的巨噬細胞。HSC中的記憶特點克服了固有免疫細胞壽命短的局限性。當然這一過程也可能產生有害的結果。處於持續活化狀態的經過訓練免疫的固有免疫細胞在暴露於內源性配體後，會導致組織損傷或者慢性炎症。這表明刺激類型、定位以及細胞類型對於促進HSC保護性或者有害性方向重排都至關重要。病原體以及PAMPs暴露是HSC產生保護性訓練免疫的重要步驟，但是該過程機制尚不清楚。

第三篇Cell文章來自加拿大McGill大學Maziar Divangahi團隊，題目為M. tuberculosis Reprograms Hematopoietic Stem Cells to Limit Myelopoiesis and Impair Trained Immunity的研究成果。該研究發現與BCG相反，Mtb通過IFN-I/鐵代謝軸在HSC下遊的髓樣祖細胞中誘導了RIPK3依賴的壞死，導致骨髓細胞減少以及針對結核桿菌的訓練免疫誘導受損。

為了探究Mtb對骨髓的影響，作者使用了與BCG相同的桿菌數量，靜脈注射後，Mtb能夠以與BCG相同的速度到達骨髓，在骨髓中的複製速度一致。在感染之後第七天BCG組和Mtb組的造血幹細胞（HSC）和多潛能祖細胞（multipotent progenitors，MPP）細胞數量沒有明顯區別。繼續觀察到14天，Mtb感染可以顯著抑制骨髓生成，促進淋巴細胞數量增加。RD1 Region of Difference 1存在於Mtb菌株中，但是BCG中沒有。所以作者構建Mtb-△RD1發現，相較於Mtb-△RD1，Mtb能夠顯著抑制骨髓再生，促進淋巴系生成。感染28天後，巨噬/樹突祖細胞 (macrophage/dendritic cell progenitors,MDPs)和單核細胞前體(common monocyte progenitors,cMoPs) 以及粒系祖細胞(granulocyte progenitors,GPs)數量顯著降低，並且髓系前體細胞數量的降低導致骨髓中成熟的髓系細胞也出現下降。

由於Mtb和BCG對於HSC的影響沒有顯著差異，而在祖細胞水平出現差異，作者推測Mtb感染會導致HSC重編程，進而調節下遊祖細胞。於是作者對感染28天後的HSC 和MPP進行轉錄組分析。分析發現Mtb感染骨髓會引起HSC產生IFN-I依賴性細胞重編程。GSEA分析顯示在Mtb感染時，IFN-I信號、糖酵解以及炎症相關基因表達升高。為了探究HSC這些變化對於固有免疫的影響，接下來作者將感染28天之後的小鼠的骨髓來源的巨噬細胞（BMDM）進行培養，體外感染髮現，Mtb組的細胞控制Mtb生長的能力受損。

由於全身感染並不能模擬結核桿菌在人體中的感染途徑，於是作者將低水平的Mtb通過氣溶膠途徑感染小鼠。作者發現1天之後，Mtb在骨髓中富集，並且能夠一直持續到檢測終點120天。在感染120天後檢測發現骨髓生成的抑制造成了中性粒細胞以及Ly6Chi的單核細胞數量下降。所以Mtb進入骨髓並抑制骨髓生成與感染途徑無關。作者接下來利用sc-RNA-seq進行單細胞轉錄組分析。分析得到了與前面一致的實驗結果（利用BCG-GFP實驗證明），細胞群Lin- c-Kit+ Sca-1+ (LKS)基因變化最為明顯。GSEA分析也發現IFN-II和IFN-I相關基因表達上升明顯，IFN信號的關鍵轉錄因子Stat1上升也較明顯。而IFN-II對於HSC擴增和骨髓生成非常重要。IFN-I則會造成幹細胞數量下降，功能障礙。於是作者推測Mtb誘導的IFN-I能夠直接影響機體的抗菌反應。作者用Ifnar1敲除的小鼠在受到Mtb感染時存活能力上升，以及利用此品系小鼠的BMDM也驗證了作者的猜想。為了檢測IFN-I對於骨髓造血的影響，作者用TLR3的配體poly(I:C)腹腔注射打入小鼠體內，發現也能夠抑制骨髓生成，阻礙保護性訓練免疫的產生。利用其它分子如β-glucan，作者發現其能夠促進骨髓生成。至此該研究發現多種信號參與骨髓生成和保護性訓練免疫誘導調控。

在細菌感染時，IFN-I信號會誘導前體細胞死亡。作者發現在Mtb感染時細胞壞死較為明顯。作者還發現介導壞死的重要分子Ripk3在受到Mtb感染時，HSC細胞中表達明顯上升。利用Ripk3敲除的小鼠作者發現，Mtb能夠誘導髓系前體細胞發生RIPK3依賴性壞死。轉錄組分析發現Mtb感染時血紅素代謝富集程度明顯下降，於是作者推測Mtb會打破鐵代謝平衡進而抑制骨髓生成。利用鐵蛋白H鏈（ferritin H chain FTH）敲除小鼠構建的鐵代謝紊亂模型發現鐵代謝紊亂時，Mtb感染敏感性上升明顯。這些結果表明IFN-I/鐵代謝軸發生異常，會嚴重損害骨髓發生，損害訓練免疫，造成Mtb易感。最後作者發現BCG和Mtb對HSC和前體細胞轉錄組影響，有助於產生保護性和有害性的訓練免疫，這種作用能夠持續至少一年。

因此該研究表明，Mtb感染時，Mtb進入骨髓並通過影響HSC轉錄組變化，促進IFN-I信號，降低鐵代謝，進而抑制骨髓生成，並削弱保護性訓練免疫的誘導，促進結核桿菌易感，而且該影響能夠持續較長時間。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.058

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.059

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.09.062