一、前言
細胞胞吞缺陷是包括阿爾茨海默病(AD)在內的神經退行性疾病的一個標誌。晚發性阿爾茨海默病全基因組關聯研究中發現，多個基因提示胞吞作用是一個關鍵的相關風險過程。胞吞缺陷在散發性AD的臨床前階段很明顯，特別是在APOE4攜帶者中。儘管APOE4與疾病風險之間的密切遺傳關聯得到認識已有20多年，但APOE4如何增加疾病風險的問題仍未得到解決。
近期，Cell Reports期刊發表了題為《PICALM Rescues Endocytic Defects Caused by the Alzheimer’s Disease Risk Factor APOE4》的研究論文，作者團隊發現(1)APOE4表達幹擾了細胞的胞吞作用，以及(2)PICALM可以恢復APOE4細胞的胞吞功能受損；阿爾茨海默病的胞吞功能受損最常與β澱粉樣蛋白(Aβ)的合成失調或清除不良有關，這一發現可能是治療幹預的一個關鍵節點和潛在的靶點。
二、主要結果
1、APOE4幹擾源於IPSC的星形膠質細胞胞吞作用
由於星形膠質細胞是人腦APOE的主要來源，作者使用IPSC來源的星形膠質細胞作為研究對象（圖1 A）。兩組細胞除APOE以外（APOE3或APOE4）的所有基因位點均相同，並驗證只表達星型細胞標誌物S100b和GFAP （圖1B），不表達其他可能汙染細胞類型的標誌物。然後系統地監視了兩組細胞胞吞途徑的多個階段（圖1C）。
首先檢測了Rab蛋白和Rab效應器蛋白的免疫螢光染色，它們專門標記早期、晚期和再循環的內含體。使用針對早期內含體相關蛋白Rab5和EEA1的免疫螢光探針直接觀察早期內含體的數量，觀察到與APOE3星形膠質細胞相比，APOE4中Rab5陽性和EEA1陽性的星形膠質細胞的數量都減少了(圖1D-1F)，表明早期的胞吞作用受到影響。
作者為了確定觀察到的早期胞吞囊泡積累的差異是否導致早期胞吞作用中的功能缺陷，使用螢光標記的配體(表皮生長因子[EGF]和轉鐵蛋白[Tf])來檢測網狀蛋白介導的胞吞早期階段，通過將細胞暴露在5分鐘的螢光EGF脈衝中，直接觀察到早期胞吞機制所吸收的EGF(圖1C、1G和1H)。
ApoE4星形膠質細胞傾向於胞吞少量的EGF(圖1G和1H)。利用螢光標記的Tf，再次觀察到APOE4星形膠質細胞比APOE3星形膠質細胞胞吞Tf少。總體而言，APOE4星形膠質細胞的早期胞吞比率低於APOE3星形膠質細胞(圖1G和1I)。
圖1.表達ApoE4的iPSC來源的星形膠質細胞在早期胞吞功能表現出缺陷
2、酵母菌APOE模型顯示人類星形膠質細胞中的胞吞異常
為了更詳細地探討APOE4對胞吞作用的影響，作者構建了麵包酵母菌APOE生物學的模型。該酵母模型在已知的基因組位點上包含穩定整合的結構，並受雌二醇誘導啟動子的控制，表達人APOE亞型（圖2A）。
在APOE4酵母模型中，早期內含體確實是異常的，與APOE3酵母相比，該模型顯示內源性標記的Rab5同源物YPT5和VPS21(圖2B和2C)的水平和定位被破壞。雖然觀察到人IPSC來源的APOE4星形膠質細胞中Rab5和EEA1的表達減少(圖1D-1F)，但在APOE4酵母中酵母同系物的水平增加(圖2C和2D)。這表明細胞類型可以極大地影響APOE4缺陷，酵母模型也可能反映了多種人類細胞類型。
為了專門監視早期的胞吞作用，作者在表達APOE3和APOE4的酵母中，使用了定量逆轉酶試驗來評估胞吞效率。這項檢測使用了由胞外蔗糖轉化酶、酵母蛋白Snc1p和胞內GFP組成的跨膜嵌合蛋白受體(GSS)。由於胞吞作用受損，GSS在細胞表面堆積導致轉化酶活性增加，而胞吐或循環缺陷則導致細胞表面GSS減少，從而降低轉化酶活性。胞吞效率是通過比色讀數的酶分析來評估(圖2D)。
作為對照，一個關鍵的早期胞吞因子SLA1的缺失導致細胞表面GSS增加，因此有更高的轉化酶信號(圖2E)。與APOE3或野生型酵母相比，表達ApoE4的酵母的轉化酶信號明顯增加(圖2E)。因此，酵母APOE4模型反映了胞吞過程中的幹擾，特別是胞吞過程中的破壞，類似於在人IPSC來源的星形膠質細胞中觀察到的那樣，因此酵母模型可以作為一種工具來識別可能改變APOE4這一效應的遺傳和化學因素
圖2. APOE4相關胞吞缺陷酵母模型
3、PICALM酵母同源基因YAP1802逆轉APOE4誘導的細胞胞吞功能受損
作者發現在酵母模型中，生長缺陷伴隨著APOE4誘導的胞吞作用的紊亂(圖3A、3B)，而APOE3並未導致生長缺陷(圖3A、3B)。接著，作者對對APOE4誘導的生長缺陷的抑制子進行了篩選，分析了34種參與細胞內轉運所有階段的蛋白質。
當過表達時，只有Yap1802p顯著影響APOE4酵母生長表型(圖3C，黃色突出顯示)，作者檢測了Yap1802p的過表達是否可以改變Rab蛋白中觀察到的失調。Yap1802p表達的增加使在表達APOE4的菌株中觀察到的Rab5同源基因的累積水平降低到APOE3水平(圖3D)。Yap1802p表達的增加也使Vps21p(Rab5同源物)的定位恢復到APOE3模式(圖3E)。
最後作者假設Yap1802p修復生長缺陷的同時是否伴隨著APOE4誘導的早期胞吞缺陷的修復。經過證實，Yap1802p的過表達導致GSS轉化酶信號顯著降低，表明Yap1802p的表達可以功能性地修復APOE4誘導的轉運缺陷(圖3F)。
圖3.提高YAP1802的表達可挽救酵母中ApoE4相關的胞吞缺陷
4、PICALM過表達對APOE4誘導的IPSC來源星形膠質細胞胞吞作用的影響
APOE4酵母模型表明，YAP1802是APOE4誘導的胞吞缺陷的強有力的遺傳修飾物。YAP1802的人類同源基因是PICALM，它本身與AD有關。因此，作者研究了PICALM是否可以改變IPSC來源的人星形膠質細胞的APOE4表型。
確認PICALM在APOE3和APOE4星形膠質細胞中的內源性表達沒有顯著差異後，作者用慢病毒處理APOE3和APOE4星形膠質細胞，該慢病毒在星形膠質細胞特異性GFAP啟動子下驅動血凝素(HA)標記表達PICALM(PICALM-HA)(圖4A和4B)。由於修改胞吞作用可能會增強或降低蛋白質的內化、循環或降解速率(，作者證實PICALM的表達不會改變APOE水平(圖4C和4D)。
為了研究PICALM過表達對APOE4誘導的胞吞過程的影響，作者再次使用螢光配體EGF和Tf作為早期胞吞過程的探針。作者發現PICALM的過表達增加了EGF攝取(圖4A、4E和4F)和Tf攝取(圖4G和4H)，這表明早期的胞吞能力得到了恢復。
圖4.增加PICALM表達修復APOE4誘導的IPSC來源星形膠質細胞胞吞損傷
三、小結
風險的具體機制，為其成為AD等神經退行性疾病的潛在治療靶點提供更多的證據支持。該研究確定了PICALM是APOE4相關缺陷的遺傳修飾物。並且提示鑑於PICALM與APOE4在胞吞作用上的共同作用，靶向這一細胞通路可能成為潛在的治療途徑。
編譯作者：文玉 (Brainnews創作團隊)
校審：胖兔子可可、Simon (Brainnews編輯部)