帶您認識流式細胞術中的各種圖

流式圖有很多種，最常用的是流式直方圖和流式散點圖，還有流式等高線圖。流式直方圖只能顯示一個通道的信息，流式散點圖和流式等高線圖可以同時顯示2個通道的信息。

流式通道

流式通道主要可以分為散射光通道和螢光通道：散射光通道有兩個，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式細胞儀均有這2個散射光通道；不同型號的流式細胞儀其螢光通道的多少差異較大，有的甚至沒有光通道。

FSC，即前向角散射，它的值代表細胞的大小。細胞體積越大，其FSC值就越大。所以可以利用細胞的FSC值初步比較細胞的大小，利用FSC值對細胞進行分群和分類。SSC，即側向角散射，它的值代表細胞的顆粒度（granularity）。細胞越不規則，細胞表面的突起越多，細胞內能夠引起雷射散射的細胞器或者顆粒性物質越多，其SSC值就越大。所以可以利用細胞的SSC值初步比較細胞的顆粒度，利用SSC值對細胞進行分群和分類。

一般在硏究細胞樣品時，首先關注的就是樣品中細胞的FSC-SSC散點圖，x軸代表FSC值，y軸代表SSC值，將細胞都顯示於該散點圖中，可以初步根據細胞的大小和顆粒度對細胞進行分群和分類。樣品細胞不需要標記任何螢光素偶聯抗體，直接上樣分析就可以得到樣品細胞的FSC值和SSC值，其值代表的是細胞的大小和顆粒度這兩個基本的物理特徵，所以樣品的FSC-SSC散點圖又稱為樣品細胞的 「物理圖」。

螢光通道表示的不是細胞特有的物理特徵，而是其化學特徵。如需要檢測樣品中是否有細胞表達某一CD分子，則需要標記螢光素偶聯的該CD分子的抗體，表達有該CD分子的細胞就會結合螢光素偶聯抗的該CD分子的抗體，表達有該CD分子的細胞就會結合螢光素偶聯抗體，其中的螢光素被相應的雷射激發後產生螢光，該螢光信號通過光路系統被相應的螢光通道接收，就能得到該樣品中是否有細胞表達該CD分子，以及有多少比例的細胞表達該CD分子等信息。螢光通道接收到的信號越強，表示細胞上結合的螢光素越多，那麼細胞表面表達的該CD分子就越多，因此可根據螢光信號的強弱判斷細胞表達該CD分子的相對數量。總之，螢光通道值反映接收到的螢光信號的強弱，從而反映細胞上結合的螢光素的量，進一步反映細胞上表達該CD分子的量，最後間接反映細胞表達某CD分子這一化學特徵。

不同細胞群的FSC值和SSC值最多相差幾倍，而螢光信號強弱之間一般相差很大，陰性細胞與陽性細胞之間、強陽性與弱陽性之間有時可以相差幾十倍、幾百倍，甚至幾千倍，呈指數關係。所以，流式圖數軸上FSC值和SsC值以「一般數序形式」表示，而螢光通道值常以「對數形式」（logarithmic scale）表示，在識圖時需要注意數軸的表示形式。當然，並不是所有的螢光通道值都以「對數形式」表示，當螢光信號值相差不多時，也可以「一般數序形式」表示，如P染色檢測細胞內DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分選側群幹細胞時，均以「一般數序形式」表示。

流式直方圖

流式直方圖形成的原理與統計學中的直方圖相似,是在統計學直方圖的基礎上進一步發展而成的。流式直方圖的x軸表示一個通道的值,y軸表示細胞數量。

流式直方圖雖不是如此簡單，但是基本原理是相同的。流式直方圖是在此統計直方圖的基礎上，使統計區間不斷地縮小，縮小到甚至可以認為一個值就是一個統計區間，使統計的細胞數量不斷地增加，增加到以萬計，甚至以十萬計時，相鄰的小統計區間內的細胞數相差不多，這時的直方圖好像是由光滑的曲線所圍成的。其實，這只是直方圖統計的細胞數達到一定量時視覺上的一個假象，這個由光滑的曲線圍成的流式直方圖實際上是由無數個非常小的統計區間組成的為了方便理解，可以認為x軸上的一個點就是一個統計區間，而曲線上該點對應的y軸值就是x軸代表的通道的螢光信號值對應的細胞數。這時，統計細胞群體比例時可以通過計算曲線下所圍的面積的比例來表示。

綜上所述，流式直方圖本質上就是統計直方圖，是累積顯示細胞量非常大而統計區間又非常小的統計直方圖。

流式散點圖

流式直方圖只能表示一個通道的信息，而流式散點圖能夠同時表示兩個通道的信息。流式散點圖也是採取坐標軸的方式，x軸表示一個通道的值，y軸表示另一個通道的值，圖中每一點代表一個細胞，該點所對應的橫坐標值就是該點所代表細胞的x軸通道的值，所對應的縱坐標值就是該點所代表細胞的y軸通道的值。

與流式直方圖相比，流式散點圖能夠同時表示兩個通道的值，能夠更加直觀地表示細胞的信息，所以流式散點圖更加直觀和常用。雖然，兩張流式直方圖也可以表示兩個通道的信息，但是兩張流式直方圖不能表示細胞這兩個通道值之間的相互關係，如不能直觀地表示其中一個通道值低的細胞其另一個通道值是高還是低，而在流式散點圖中卻可以非常直觀地發現細胞群體中這兩個通道值的相互高低關係，從而更易於細胞分群、分類，以及確定比例關係等。

下圖所示的是某正常人外周血白細胞FSC－SSC散點圖。FSC代表細胞的大小，SSC代表細胞的顆粒度，從圖中可以看出，根據細胞的大小和顆粒度，正常人外周血白細胞可以分為3群。進一步研究發現：小細胞、小顆粒度的紅色細胞群是淋巴細胞群，T細胞、B細胞和NK細胞都位於此淋巴細胞群；中細胞、中顆粒度的綠色細胞群是單核細胞群大細胞、大顆粒度的黃色細胞群是中性粒細胞群。

一般在流式分析過程中，先利用FSC-SC物理圖根據細胞的大小和顆粒度將細胞進行分群，然後根據目標細胞處於哪個群體，再將該群體細胞設門（setgate），進一步分析該群體中的目標細胞。

門（gate）是流式分析過程中一個較為重要的概念，流式分析時有時不希望所有的樣品細胞都顯示於流式圖中，而是希望只顯示感興趣的細胞，排除其他非相關細胞的幹擾，使顯示的信息更加直觀，更具有針對性。例如，分析CD25+調節性T細胞佔CD4+T細胞的比例時，樣品細胞是小鼠脾臟單個核細胞，此時可以根據CD4的表達情況，將CD4+T細胞設門顯示於一個新的流式圖中，則該流式圖只顯示所設門內的細胞，即只顯示CD4+T細胞，其他無關細胞不會被顯示。在相應散點圖中x軸代表CD4信息，軸代表CD25信息，這樣就可以非常直觀地計算出調節性T細胞的比例。

下圖所示的是正常C57小鼠的脾臟淋巴細胞分群的流式散點圖。

圖A是所有脾臟單個核細胞的FSC-SSC散點圖，設門淋巴細胞群顯示於圖B和圖D所示的散點圖中。圖B所示的是脾臟淋巴細胞的CD3-CD19散點圖，從圖中可以看出，脾臟淋巴細胞主要包括CD3+CD19-T淋巴細胞和CD3-CD19+B淋巴細胞兩群細胞，分別佔總淋巴細胞的36.4％和58.3％，牌髒中的B細胞要多於T細胞。圖C所示的是將圖B中的B細胞設門後顯示的CD19-CD5散點圖，CD5+B1 B細胞佔所有脾臟B細胞的7.5％，說明小鼠脾臟中的B細胞絕大多數是經典的CD5-B2B細胞。圖D所示的是脾臟淋巴細胞的CD3-NK1.1散點圖，主要可以分為CD3+NK1.1-T細胞、CD3-NK1.1+NK細胞和CD3-NK1.1-B淋巴細胞，脾臟淋巴細胞中的NK細胞比例較低，只佔3.5％。圖E所示的是將圖B中的T細胞設門後顯示的CD4-CD8散點圖，從圖中可以看出，CD4+T細胞和CD8+T細胞分別佔55.6％和40.2％，脾臟中的T細胞以CD4+T細胞為主。圖F所示的是將圖E中的CD4+T細胞設門後顯示的CD4-CD25散點圖，CD25+調節性T細胞佔所有CD4T細胞的15.8％，說明在正常情況下牌髒中調節性T細胞的比例較低。

通過對以上流式散點圖的分析，讓我們對正常小鼠牌髒淋巴細胞分群有了大致的了解。從這個實例也可以看出，流式散點圖比流式直方圖顯示更多的信息。

流式等高線圖

流式等高線圖與流式散點圖相似，一張流式等高線圖也能同時顯示兩個通道的信息，所不同的是，它藉助地理等高線圖的形式。地理等高線圖用封閉的環線代表海拔高度相同的地方，環線聚集越多，表示海拔高度變化越快，環線的中央區域表示海拔最高或者最低的區域。流式等高線圖藉助地理等高線圖表示細胞的密集程度，流式等高線圖的環線代表的是細胞密度相同的區域，所以，環線聚集越多的地方表示此區域細胞密度變化越快，細胞最稀疏的地方還是用散點表示，環線的中央區域代表細胞聚集的中心。

流式等高線圖的意義和實際應用與流式散點圖較為相似，可以看作是流式散點圖的一個變體。相比之下，流式散點圖更為直觀，所以應用也更為廣泛。當然，流式等高線圖也有其自身的優點，它較能直觀地體現細胞群的集中點，等密度環線的中央區域代表一個細胞群的集中點，一般代表一個細胞群，所以在某些情況下，流式等高線圖比流式散點圖更能直觀地體現細胞的分群。

下圖顯示的是正常C57小鼠脾臟淋巴細胞分群的流式等高線圖。