2.幽門螺桿菌的基礎實驗研究--大鼠實驗性幽門螺桿菌感染

2021-01-09 生物谷

2．幽門螺桿菌的基礎實驗研究

大鼠實驗性幽門螺桿菌感染

　　研究表明，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）與胃炎、消化性潰瘍等胃部疾患密切相關，為此，我們對某些實驗性動物進行實驗，結果發現Wistar大鼠經口感染Hp，可導致實驗性感染。從其胃組織中檢查到並分離出Hp，黏膜組織亦顯示某些病理變化。從而為研究Hp實驗性感染提供較為合適的一種動物模型。

　　1 材料和方法

　　1.1 菌株 幽門螺桿菌Hp379及Hp404株，系北京市積水潭醫院消化內科就診的胃病患者，經由內窺鏡取得的胃黏膜進行細菌培養分離到的。經過鑑定，由本室傳代保存。

　　1.2 動物 Wistar大鼠，購自中國醫學科學院實驗動物研究所。紐西蘭種家兔，C57和BALB/小鼠，由本所動物室供給。

　　1.3 感染方法 Wistar大鼠的實驗分2次進行。第1次用出生5個月（體重175g～254g）的成年鼠，第2次用出生兩個月（體重152g～174g）的幼齡鼠。動物先禁食12h～14h，用胃管餵以5%Na2HCO32ml,15min後用胃管注入Hp379或Hp404株的菌液1.5ml(1010CFU/ml,30min後給食。每周感染1次，共4次。對照組動物不感染Hp，飼養條件與實驗組相同。用以感染的家兔為幼齡兔（體重1200g～1500g）。C57小鼠為4周齡幼鼠（10g～12g），BABL/C用成年鼠（18g～20g）。感染方法同大鼠，家兔每次感染量為2ml，小鼠為0.5ml(1010CFU/ ml)，每周感染1次，共5次。動物在最後1次感染後的第7d～10d，禁食12h～14h後，乙醚麻醉處死，無菌操作取出胃，用滅菌PBS洗去胃內容物，從靠近幽門端的不同部位剪取胃黏膜3～4小塊，加含10%小牛血清的布氏肉湯2ml，用組織研磨器製成漿，用以做尿素酶試驗，直接塗片檢菌和細菌培養。其餘的胃組織用10%甲醛（PBS配製）固定，供病理學檢查。

　　1.4　 細菌學檢查　①尿素酶試驗基本參考Morris等的方法。②胃黏膜直接塗片檢菌法：取黏膜勻漿滴推成塗片，用甲醇固定10min，0.3%鹼性復紅染色，鏡檢Hp菌。③Hp菌培養：以布氏瓊脂為基礎，加入6%脫纖維羊血及脫氧胸苷酸（TMP）5mg/L，萬古黴素6mg/L，兩性黴素2mg/L，製成血平板後，置4°C保存備用。取胃黏膜勻漿0.2ml於血平板後，塗勻後放入含10%CO2、5%O2及85%N2的混合氣體培養箱中，57°C培養72h後觀察結果。

　　1.5 病理學檢查 　甲醛固定的胃組織,石蠟包埋，切成6μm厚的組織切片。分別用蘇木素-伊紅和Warthin-Starry鍍銀染色，觀察病理改變和檢查組織切片中的Hp。

　　2 結果

　　2.1　尿素酶試驗　經口感染Hp的8隻大鼠，其胃黏膜做尿素酶試驗，多數在4h內，個別的24h出現陽性反應。對照組大鼠的胃黏膜呈陰性反應。經哭喊Hp的家兔、C57和BALA/C小鼠的胃黏膜，均呈陰性反應。

　　2.2 　塗片細菌檢查　 感染Hp的8隻大鼠的胃黏膜勻漿，製成塗片染色後鏡檢，均檢查到Hp。未感染的大鼠胃黏膜塗片未找到Hp。感染Hp的兔、C57和BALB/C小鼠的胃黏膜塗片亦未檢查到Hp。

　　2.3 細菌培養 各組動物的胃黏膜組織都做了Hp培養，結果只有感染Hp的大鼠胃組織，分離出Hp。其他各組均款培養出Hp。

　　2.4 組織切片細菌檢查 胃黏膜組織切片用Warthin-Starry染色，背景為淡黃色，Hp染色成黑色。感染Hp的大鼠，無論是幼齡鼠或是成年鼠，其胃黏膜切片中均可找到Hp，它們主要分布於粘液層。黏膜上皮細胞的表面和黏膜的隱窩處。切片中的Hp形成呈半圓、S或螺旋狀，未感染Hp的正常大鼠，胃組織中未找到Hp。感染Hp 的家兔、C57和BALB/C小鼠的胃切片中，亦未檢到Hp。

　　2.5 病理組織學檢查 感染Hp大鼠的胃組織切片中，可見黏膜上皮細胞變性病灶，細胞腫脹而變得不規則，胞漿內結構不清或消失。黏膜層見有單個核細胞浸潤病灶。

　　3 討論

　　上述結果表明Wistar大鼠對Hp易感。經口感染Hp，可從其胃黏膜中檢查到並分離出Hp，胃黏膜亦出現病變。與之相反，家兔、C57和BALB/C小鼠，示能引起Hp的實驗性感染。Ehler曾用Lewis大鼠，C57BL/6和BALB/C小鼠做實驗，試圖建立Hp的動物模型，未獲成功。他們的小鼠實驗結果與我們的結果相同，都是陰性。但大鼠的實驗結果不同。可能是因為實驗條件不同的緣故。

　　自從1983年首先從人胃中分離到Hp以後，相繼從水貂和恆河猴的胃組織中分離出Hp樣細菌。那麼，我們從感染的Wistar大鼠胃組織中分離到的Hp是否亦是自然存在的呢？看來，這種可能性不大。因為，如前所述，未感染的對照組大鼠，用各種方法檢測，都沒有檢查到Hp菌

　　最近報導悉生仔豬經口感染Hp，可從胃組織中分離出Hp。但用悉生仔豬做實驗，不但費用昂貴，而且不方便。根據本實驗結果，我們認為Wistar大鼠，尤其是幼齡鼠，是研究Hp菌較為理想的動物模型。但是，多次感染是必要的。

陳晶晶 姚楚錚 莊弢 盧文紅

中國預防醫學科學院流行病學微生物學研究所（北京 102206）

*國家自然科學基金資助課題

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