CCK8細胞增值檢測實驗簡介

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    CCK-8（Cell Counting Kit-8）細胞活性和增殖檢測是醫學研究中常用的實驗技術，其原理是該試劑中含有WST-8，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。以下是CCK-8檢測的具體步驟：

細胞活性檢測

1. 在96 孔板中接種細胞懸液 (100 ml /孔 ) 。將培養板放在培養箱預培養 (在37 ℃，5% CO2的條件下 )。

2. 向每孔加入10 ml 的CCK- 8溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 O.D值的讀數) 。

3. 將培養板在培養箱內孵育 1-4小時。

4. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

5. 如果暫時不測定O.D值，打算以後測定的話，可以向每孔中加入 10 ml0.1 M HCl溶液或者1% w/vSDS 溶液，並遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24小時內吸光度不會發生變化。

細胞增殖 -毒性檢測

1. 在96 孔板中配製 100 ml的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養 24小時 ( 在37℃， 5% CO2的條件下 )。

2. 向培養板加入10 ml不同濃度的待測物質。

3. 將培養板在培養箱孵育一段適當的時間 (例如: 6,12, 24 或48小時 )。

4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 (注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響 O.D值的讀數) 。

5. 將培養板在培養箱內孵育 1-4小時。

6. 用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

7. 如果暫時不測定O.D值，打算以後測定的話，可以向每孔中加入 10 ml 0.1 M HCl溶液或者1%w/vSDS 溶液，並遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在 24小時內吸光度不會發生變化。

注意：如果待測物質有氧化性或還原性的話，可在加 CCK-8之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可。

製作標準曲線

1. 先用細胞計數板計數所製備的細胞懸液中的細胞數量，然後接種細胞。

2. 按比例 ( 例如：1/2比例 ) 依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 3-5個細胞濃度梯度，每組3-6個復孔。

3. 接種後培養2-4 小時使細胞貼壁，然後加 CCK-8試劑培養一定時間後測定 O.D值，製作出一條以細胞數量為橫坐標 (X軸) ，O.D值為縱坐標 (Y軸) 的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量 (使用此標準曲線的前提條件是實驗的條件要一致，便於確定細胞的接種數量以及加入 CCK-8後的培養時間)。

   

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