研究:新一代測序技術開闢古基因研究新競技場

原標題：「老骨頭」的新生命——新一代測序技術開闢古基因研究新競技場

　　通過這根在西伯利亞Ust』-Ishim地區發現的距今4.5萬年的股骨，研究人員對人類最古老的基因進行了測序。圖片來源：ALEXANDER MAKLAKOV

　　當Kelly Harkins的博士研究——古結核病在2012年陷入僵局之後，她開始向更廣泛的學界尋求幫助。她離開了美國亞利桑那州立大學（ASU）實驗室，到德國圖賓根大學進行4個月的訪問。在該校古遺傳學家Johannes Krause的實驗室中，她聽從了導師的建議：「做一個像一塊海綿的研究者。」她學會了如何用複雜的下一代DNA測序技術檢測古老的人體組織樣本。

　　「後來我回到美國，把這項技術教給了ASU的所有研究生。」她說。這項精準的、有著上百年歷史的微生物測序技術讓她取得了一項驚人的發現：新世界（即南、北美洲及其附近島嶼）的古結核病有可能來自於海洋哺乳動物。

　　Harkins的經歷和古遺傳學研究領域的開拓者Svante P?覿?覿bo可謂異曲同工。上世紀80年代初，作為瑞典本土的一名研究生，P?覿?覿bo希望可以分析古木乃伊DNA，以找到現代埃及人和古代法老是否存在密切關聯。但他擔心導師可能會認為這項研究將徒勞無功。所以他只在晚上和周末作這項研究。「這是我『真正』博士工作之外的副業，我一直在秘密地進行。」P?覿?覿bo說，「而且只有我一個人。」

　　測序革命

　　但是P?覿?覿bo和該領域其他一些先行者在研究過程中認識到，通過把DNA測序應用到經過時光破壞的古人體組織上，他們正在進行一場DNA測序革命。他們取得了出乎所有人預料的結果，最終追溯了尼安德特人和其他古人類的整個基因組序列，並繪製了人類進化路線圖。研究人員還追溯了古動物的基因組序列，如迄今為止最古老的、距今70萬年的馬。但提取和分析退化DNA分子十分棘手，多年來該技術僅局限於為數不多的若干引人注目的實驗室中。

　　現在，情況已然改變。隨著測序和樣本分析技術的提高，古人類學領域之外的研究人員已經意識到，古DNA可以告訴他們大量線索，目前該方法已被應用於從歐洲人口變遷到植物和病原體如何響應氣候變化等各類研究中。「我們現在已經看到了相關研究的集中暴發。」P?覿?覿bo說，「古DNA即將變成一種標準工具……成為許多研究項目不可分割的一部分……就像碳年代測定一樣。」

　　「這是一場革命。」Krause對此持同樣看法，最近他剛從圖賓根搬到耶拿，聯合主持馬普學會新人類歷史科學研究中心。「現在，人人都可以利用這項技術，你可以和小實驗室合作，發表高影響力的出版物。你也不需要多麼精尖的設備，只需要知道怎麼做。而現在已經有越來越多的人知道怎麼做。」

　　上世紀80年代，在首個古DNA測序成功之後，這一領域一直受到樣本汙染的困擾，因為古DNA會被來自現代細菌或是技術人員手指的基因物質汙染。最初，研究人員依靠聚合酶鏈反應（PCR）對古樣本中生存的微小DNA片段進行擴大或測序，但是PCR會優先擴大較長的分子，而這些分子更有可能是來自現代的汙染。比如，大量來自恐龍、美洲土著以及琥珀中昆蟲的DNA結果均被汙染，P?覿?覿bo甚至也曾表示，幾乎因此而放棄古人類樣本研究。

　　然而，隨著下一代測序技術不斷發展，如今研究人員可同時對上千萬個DNA片段測序，有時一天內就會檢測出整個基因組序列。這種高通量測序方法不僅加快了測序速度，而且降低了成本，儘管配備一臺古DNA測序設備依然昂貴。下一代測序技術不需要依賴PCR重構分子。新的測序方法可以對序列進行分析，這樣一來「傳說中的」古DNA手印——可能是以某種核苷酸為基礎的優先退化——就可以得到辨識。缺乏該模式的序列可能就是現代汙染，就可以被識別出來並丟棄掉。「其實，仍然要考慮到汙染問題。」Harkins說，「但這種顧慮已經減少了許多。」

　　所有這些進步加上新的樣品前處理方法，就可以讓化石中的任何DNA的利用最大化。「15年前，我從未想過居然可以像現代人那樣，對已經滅絕的早期智人測序。」P?覿?覿bo說，他的實驗室利用下一代測序技術在2010年對尼安德特人的完整核基因組序列進行了檢測，並在2012年被廣泛報導。

　　黃金時代

　　隨著越來越多的實驗室可以探索古DNA，它們逐漸把這一技術推廣應用至許多新問題上。這些後來者「可以做一些我以前從未夢想會做的事情」，比如檢測百萬人基因組項目。加拿大麥克馬斯特大學進化遺傳學家Hendrik Poinar說：「我們正處於古DNA分析的黃金時代。」

　　據湯森路透科學網站數據統計，論文題目、摘要或關鍵詞中含有「古DNA」一詞的文章越來越多，相關論文已從1995年發表的30篇上升至2014年的275篇。其中約有14篇研究成果深入報告了關於早期智人的研究成果，其引用率尤其高，湯森路透分析專家把它們稱作「研究前沿」。這些文章在2013年大量湧現，表明了一個以相對新穎的文獻為基礎的新領域的興起。

　　儘管古DNA分析已經變得越來越強大和標準化，研究人員仍在找尋新的地方進行古基因序列檢測。質密耳骨中保存的DNA驚人地完好，牙齒上的噬斑也是如此，這些為了解古代人飲食及腸道菌群打開了新的競技場。其他研究人員則在對古代土壤或冰體中發現的DNA進行測序，以重新構建歷史上的生態系統。還有研究人員在探索如何把在熱帶雨林中發現樣本的古DNA提取出來，因為那裡炎熱和溼潤的氣候會破壞有機體分子。還有一些研究人員在觀察該領域研究的地平線，分析古蛋白質測序的下一項突破性技術可能是什麼。

　　然而，目前來看，古遺傳學仍佔據主導地位，甚至吸引了其他跨度較大的學科領域研究人員的注意力。「我對古DNA本身沒什麼興趣，我主要是對那些仍然影響現代人生活的疾病感興趣。」微生物學家、現在路易斯安那州巴吞魯日國家麻風病項目中心做訪問學者的Pushpendra Singh說。但是他和瑞士聯邦理工學院時任博士後導師Stewart Cole希望了解，和1000年前相比，為什麼今天歐洲人得麻風病的人數少得多。是不是因為隨著時間的演變，麻風分枝桿菌的毒性變弱了？

　　為了了解其中的原因，Singh也到圖賓根大學訪問，在Krause的實驗室學習古DNA研究技術。最終，該團隊對5種中世紀樣本進行了測序，其中包括一種DNA保存特別完整的微生物。在和Cole、Krause以及其他同事的合作過程中，他發現中世紀時的麻風菌基因序列和現在大體相同，而其他一些因素——比如或與其他疾病發生合併感染或是保護突變的進化——可能有助於解釋麻風病在歐洲感染率的下降。

　　其他的實驗室也在探索從古米諾斯人和古邁錫尼人之間的關係到馬鈴薯疫病的家庭譜系等各種問題。「現在，我每周都會接到研究人員的電話，希望給他們提出建議。」Krause說。

　　競技實力

　　與此同時，為數不多的若干個精英實驗室因為有大批資金的支持，依然在該領域遙遙領先。正如Krause所形容的那樣，這些「巨頭」在研究新技術，解決更加複雜的問題。「我們的策略是探索那些有難度的問題，走在科技的前沿。」P?覿?覿bo說，他給自己的團隊提出的挑戰是，在未來5年至少對100名距今3萬年以上的古人類基因進行測序。「我們把它叫作『100名古人類基因』項目。」他說。

　　年代如此久遠的古樣本序列經常要反覆檢測二三十次，甚至是四十多次，每次測序的花費需要2000美元甚至更高，以增加測序結果的可靠性。「現在，要把這些事情做好，成本仍然很昂貴。」加州大學伯克利分校人類遺傳學家Rasmus Nielsen說。

　　同樣，古基因汙染問題也依然存在。但無論如何，對於Harkins這代科學家來說，已經面臨著伴隨該領域迅速崛起的熱潮而來的各種問題，包括激烈競爭。「比如，現在全球至少有5個實驗室在進行猛獁象基因測序，銅器時代的古人類基因測序也是如此。」Krause說。

　　但Harkins表示，該領域同樣有許多挑戰性的科學問題亟待解決。「我們可以研究人口層面的問題，可以研究免疫學相關的問題。總之，除了這種選擇，總會有另外一種選擇。」她說。「這的確是個很棒的領域。」