史上最全的CAR-T在難治或復發性慢性淋巴細胞白血病治療中的臨床...

難治性或多次復發的慢性淋巴細胞白血病（CLL）的患者預後較差。靶向CD19的嵌合抗原受體（CAR）T細胞對B細胞惡性腫瘤的持續緩解，具有提高常規療法低緩解率的潛力。我們曾經報導過3例難治性CLL治療的初步研究結果。現在我們報導使用CAR-T細胞治療的14例復發性難治性CLL患者的初步試驗中成熟的研究結果。用慢病毒載體導入CD19 CAR的自體T細胞（CTL019），輸注給復發/難治性CLL患者，輸注劑量為0.14×108到11×108 CTL019細胞（平均1.6×108細胞）。對患者體內的CTL019進行毒性，應答，擴增和持續性進行監測。經多次治療的CLL患者中，總有效率為8/14(57%)，其中4名患者完全緩解（CR），4名患者部分緩解（PR）。體內CAR-T細胞的擴增與臨床應答相關，前2名獲得CR的患者，體內CAR-T細胞功能持久保持超過4年。CR的患者疾病都沒有出現復發。所有應答的患者出現B細胞再生障礙和細胞因子釋放症候群都與CAR-T細胞的擴增相關。在獲得CR的患者身上檢測不到微小殘留病灶，這表明了治癒晚期CLL患者成為可能。（下一代CAR與免疫細胞治療研討會即將在11.7上海召開！）

前言

慢性淋巴細胞白血病（CLL）是成人白血病中最常見的類型。CLL的病程變化很大，總生存期為2年到20年。儘管有很多有效的療法，但傳統療法CLL無法被治癒，病情惡化亦不可避免。雖然可通過同種異體造血幹細胞移植來治癒部分患者，但這也有較高的發病率和死亡率，並且有許多CLL患者不適合移植治療。難治性或多次復發的CLL患者預後較差，其總生存期由前期的無進展生存期決定。

CD19嵌合抗原受體（CAR）修飾的T細胞是CLL和其他B細胞惡性腫瘤的一個不錯的治療方法。CAR是通過基因改造，由結合靶向抗體的單鏈可變區（scFv）與胞內信號和共刺激域組成的分子。早期嘗試使用的CAR修飾的T細胞靶向惡性腫瘤，受到體內擴增和最低持續時間不足的限制，或因正常組織表達靶向抗原引起脫靶毒性。CTL019（以前稱CART19）表達的CAR，由抗-CD19 scFv與CD3ζ信號區和4-1BB（CD137）共刺激域構成，在小鼠模型中，這種CAR分子修飾的T細胞能持久表達並保持抗腫瘤活性。由於CD19隻表達在正常和惡性B細胞表面，不表達於其他細胞，所以靶向正常細胞的毒性有限。

我們和其他的研究者在之前的研究中發現，有少數患有復發或難治性CLL，急性淋巴細胞白血病（ALL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）的患者，在接受CD19 CAR-T治療後能保持長時間的完全緩解（CRs）。現在我們報告CTL019臨床試驗中14例患者成熟的結果。從我的研究中可以看出，CTL019在體內強力擴增後，表現出長期穩定的活性，部分復發性/難治性CLL患者獲得深度緩解，持續緩解與活性的持久穩定相關。

結果

患者的狀況

23例CLL患者納入本次研究，其中14例患者輸注至少一個劑量的CTL019（見圖S1）。9例沒有進行治療的患者中，3名在細胞輸注前因併發症去世，4名主動退出，2名沒有通過篩選。14例接受治療的患者詳情列於表1中。14例患者中，12例男性2例女性，平均年齡為66歲（年齡範圍51~78歲）。之前患者平均接受過5次治療（範圍1-11），8例患者染色體17p（TP53）缺失。1例患者接受2次自體幹細胞移植，1例患者在ibrutinib治療後疾病進展。所有患者在輸注CTL019時處於疾病進展狀態。在10例患者的骨髓活檢報告中，淋巴細胞刪除性化療前骨髓中淋巴細胞比例平均為87%（範圍40%-95%）。淋巴細胞刪除性化療方案中，氟達拉濱/環磷醯胺3例，噴司他丁/環磷醯胺5例，苯達莫司汀6例。

CTL019製備的可行性和產品特性

產品特性已在表S1中概括。除了1例患者，其餘全部滿足總有核細胞（TNCs）靶向製品的劑量範圍1.5×107到5×109 ，患者接受TNCs平均劑量是7.5 ×108(範圍1.7 × 108到50 × 108)。CTL019細胞是指改造的表達CAR的T細胞，14份製品的平均轉導效率為20.1%（範圍：4.7-39.2%），輸注的CTL019總劑量平均為1.6 × 108細胞 (範圍，0.14 × 108- 11 × 108)，分3天輸完。8例患者（57%）完成了3天分散劑量輸注方案；3例患者輸注了1天（製備總量的10%），3例患輸注了2天（製備總量的40%），而且在輸注後不到24小時出現發燒，這跟輸注細胞劑量的變化有一些關係。輸注的細胞製品中CD4陽性細胞平均佔81%（範圍：68%~95%），CD8陽性細胞平均佔20%（範圍：4.6%~34%）。

用流式細胞儀檢測12例患者細胞製品靶向CD19陽性靶標的活性，測定脫顆粒來衡量細胞毒性，並檢測胞內細胞因子的水平。12份製品都顯示了靶向CD19的高細胞毒性，並高表達了大部分細胞因子，這說明了這些患者的CTL019表達了具有功能的CAR（圖S2）。

患者的治療效果：療效和生存率

療效評判以國際研討會CLL組療效標準為基準。此外，隨著時間的推移，對每例患者進行免疫球蛋白重鏈（IGH）基因位深度測序分析，以用作血液和骨髓的疾病檢測。最佳的總體應答率和療效歸納於表2中。14例接受治療的患者平均隨訪期為19個月（範圍6~53個月）。8/14例患者（57%；置信區間(CI)精確到95%， 29~82%）出現應答。4例患者完全緩解（CR）。患者獲得CR並且沒有出現復發平均為40個月（範圍， 21 ~53個月，從輸注完畢開始計算）。緩解包括清除了微小殘餘病灶（MRD），對01、02、09號受試者在第1個月和對10號受試者在第三個月進行深度測序分析評估，在其血液和骨髓中沒有發現CLL克隆的存在（表3，表S2）。CTL019輸注後，其中3位患者仍然健在，保持疾病無復發23到58個月。09號受試者也獲得CR，在CTL019輸注後第15個月接受小腿基底細胞癌切除術，在CTL019輸注後的第21個月，手術部位發生感染並導致了致命的綠膿桿菌敗血症和膿包壞疽。

在CTL019輸注後的一個月內4例受試者（03， 05， 12和 22）獲得部分緩解（PR），4例獲得PR的患者平均應答持續時間為7個月（範圍5-13個月）。其中2例患者（03和05）血象、骨髓和淋巴結都有好轉，但他們在輸注後4個月疾病進展。第12號受試者骨髓被廣泛浸潤，輸血依賴，廣泛淋巴結腫大，在接受治療後獲得PR。輸注後，他體內的CTL019經過2次對數擴增，完全清除了血液和骨髓中的CLL，並且腫大的淋巴結消退＞50%。這例患者在T細胞輸注6個月後死於大規模肺栓塞併發症，但是他的血液和骨髓中都沒檢測到CLL存在的證據。

表2.受試者的治療與臨床表現（N=14）。 DLBCL，瀰漫大B細胞淋巴瘤； NED，沒有疾病的證據； NR，無反應。 MRD通過深度測序分析，在材料和方法中表述。

表3. 血液和骨髓IGH深度測序分析顯示，受試者01和02CLL細胞和B細胞被清除。BM：骨髓；PB：外周血；Mo：月；Yr：年。

屍檢發現，腫大的腹部淋巴結取樣中有殘餘的CLL浸潤。22號受試者也存在廣泛的骨髓浸潤，循環性疾病和嚴重淋巴結腫大。CTL019輸注後3個月，血液和骨髓中CLL被完全清除，腫大的淋巴結消退＞50%，獲得PR並持續6個月。輸注9個月後，其淋巴結迅速腫大，淋巴結活檢顯示為CD19陰性CLL瀰漫大B細胞淋巴瘤（Richter's轉化）。骨髓活檢顯示約有15%CLL浸潤並大量轉化為淋巴細胞。雖然在疾病進展時可以在血液和骨髓中通過定量聚合酶鏈反應（qPCR）可以檢測到CTL019，而在發生轉化和復發時，通過流式細胞儀在血液，骨髓和淋巴結活檢中都檢測不到CTL019。

6例受試者在CTL019輸注後沒出現應答，6例受試者進展期在1到9個月內（平均4個月），這6例患者T細胞擴增受到阻礙（平均420 copies/mg； 範圍6.5到13876或總CD3+ T細胞的0.2%）。這些患者的CLL在體外培養不耐受裂解。這6例受試者中有2例已經死亡，1例在CTL019輸注8個月後死於CLL併發症和感染，另1例在CTL019輸注9個月和進行其他兩項CLL治療方案（ofatumumab和CHOP）後死於同種異體造血幹細胞移植的併發症。其他4例受試者在CTL019輸注9到15個月後仍然健在，他們都接受了其他替代治療。

14例患者白血病對CTL019的應答都通過IGH深度測序來評估（表3和表S2），有4例患者被確定產生響應：(i)CTL019輸注後白血病克隆快速持續消失，MRD被清除(受試者01，02和09)。在輸注後，對受試者01，02和09外周血DNA檢測分別長達4年，2年和1年，在任何一次檢測中都未發現白血病克隆；(ii)CTL019輸注後3個月通過深度測序可確定隨著分子水平緩解，CTL019輸注會有MRD完全清除的延時性；(iii) 有些患者會出現白血病克隆短暫的完全(受試者22)或不完全(受試者03，05，12，17和25)消失；(iv) 在06，07，14和18受試者中CTL019未能導致IGH序列數和白血病克隆的降低。

14例受試者總生存期平均約為29個月，總生存期18個月佔71% (95% CI， 40.6 to 88.2%)。無進展生存期平均約為7個月，無進展生存期18個月佔28.6% (95% CI， 8.8 to 52.4%) (圖1和表S6).然而1例獲得CR的受試者在輸注21個月後死於感染併發症，獲得CR的患者疾病沒有再出現進展。其他所有患者在輸注1到10個月後出現疾病進展或死於疾病復發引起的併發症。

如圖S1所示，這項研究篩選了23例患者，其中9例未接受治療。5名患者未能入組，因為他們未能通過篩查或拒絕加入。因此，共18例患者加入，其中4例患者未接受治療，因為他們在接受治療前病情迅速惡化和（或）死亡（n=3），或有找到有利的替代治療主動退出研究（n=1）。因為這種細胞治療方式從入選到開始治療會有延時，我們對18例入選者全部進行PFS分析。確認18例受試者中位PFS為9個月(95% CI， 3~13.6)。

圖1：總生存率和PFS。（A和B）總生存期（A）和PFS（B）的Kaplan-Meier曲線評估14例受試者。陰影區表示95CI。受試者風險數每隔3個月標記一次。縱向標刻度表示審查數據的時間點（源數據，表S6。）

患者的年齡，既往治療的次數，入組階段，染色體17p的缺失，IGHV突變量和CTL019細胞劑量與應答之間沒有明顯統計學差異(所有P >0.05，表S3)。因為所有的患者都是晚期，不能確定疾病負荷與應答之間的關聯。在治療前我們對CLL上CD19的表達水平進行了分析，出現應答與沒有出現應答的受試者CD19螢光強度均值沒有區別，這說明靶標密度不能對應答進行預測。

CTL019在體內的擴增與持久性

用流式細胞術對CTL019細胞的持久性和定量檢測（轉導和CAR表達）來確定T細胞抗-CD19 CAR的表達，通過qPCR來識別基因修飾的T細胞。擴增的程度和持久性的持續時間與應答呈正相關（圖2和表S7）。在大多數情況下CTL019的擴增與細胞因子釋放症候群（CRS）相一致（後述），全部有應答的患者CAR-T細胞都擴增到了較高的水平。

4名獲得CR的患者，通過qPCR測得CTL019擴增峰值達25070到409645 (均值73237) 拷貝數/mg；在這些受試者中，流式細胞術檢測CTL019細胞中CD3+細胞最高比例為34.3%，外周血單個核細胞（PBMCs）中CD3+細胞最高比例為81.9%。通過qPCR檢測，4例獲得PR的患者細胞擴增度相對要低(範圍：1607到130，258； 均值33，453拷貝數/mg)，CD3+比例均值為18.3%。沒有響應的患者擴增度最低(範圍6.5到13876，均值420拷貝數/mg)，流式細胞術檢測總CD3+比例平均為0.2%。CTL019的峰值與響應有統計學關聯(圖 3 和表S8) (qPCR，P = 0.013；流式細胞術， P = 0.008)。

通過流式細胞術和qPCR，對4例獲得CR的患者進行14到49個月的CTL019持久性的觀察(圖4A和表S9)。直至最後一次持續性檢測，4例患者一直都有B細胞再生障礙，本文編譯作者愛康得Paul認為通過B細胞再生障礙可以反映CTL019功能的持續存在。此外，CTL019持久存在的直接證據是，在細胞輸注後3年，02號受試者體內提取到了CAR修飾的T細胞；這些CTL019仍然保持對CD19+靶標的特異性和直接殺傷能力，這至少彰顯了輸注數年後，這些細胞沒有耗竭並且仍保持功能。

毒性

CTL019輸注的耐受性良好。輸液反應罕見並且溫和（等級<2），主要包括低燒和輕度寒戰。

在CTL019輸注過程中沒有患者發生顯著不適。最常見的相關性事件是中心粒細胞減少併發症（包括發燒）和與體內CTL擴增相關的遲發性CRS。有2例腫瘤溶解症候群記錄。1例獲得緩解的患者在細胞輸注21個月後死亡，皮膚活檢顯示，傷口感染了假單胞菌引發了致命性膿瘡壞疽。

細胞因子釋放症候群和巨噬細胞活化症候群

CRS症狀從輕微到嚴重並常有自限性。CRS症狀包括發燒，肌肉酸痛和噁心，在嚴重的情況下會出現低血壓，毛細血管滲漏和缺氧。CTCAE（不良反應通用術語標準）3.0版將CRS定義為急性輸液毒性反應，但是不能對CTL019給藥幾天後發生的遲發性CRS進行解釋。因此我們設計了一份CRS新評價標準（表S4中，A和B）。此外在CRS中我們也注意到，並發血細胞減少症，凝血功能障礙，CD163染色法病理診斷巨噬細胞高度活化，有1例患者在CRS高峰期，骨髓活檢發現噬血現象。在鐵蛋白，C-反應蛋白（CRP）和可溶性白介素-2受體（sIL-2R）顯著升高的CRS患者中，都會出現巨噬細胞活化症候群（MAS）或噬血細胞性淋巴組織細胞增多症（HLH）。9例患者在CTL019輸注1~14天（平均7天）後發生CRS，包括1例1級，2例2級，2例3級和4例4級。在輸注後平均9.5天（範圍9~55天），有5例患者的CRS需要用抗細胞因子定向治療，4例患者重症監護病房(ICU)護理CRS相關的併發症，如低血壓和缺氧，ICU護理平均6天（範圍4~9天）。

圖2：qPCR檢測頭12個月CTL019的擴增。通過qPCR檢測14例受試者基因組DNA每微克拷貝數，來衡量外周血中CTL019的擴增。低於檢測下限值（<25拷貝數/毫克DNA）用空心圓表示（源數據，表S7）。

圖3：擴增高峰與應答之間的關係。對11例受試者用流式細胞術（A）和對14例受試者用定量PCR（B）測定前3個月CTL019的擴增高峰。未能用流式細胞術對01，02，03號受試者進行檢測，因為在他們治療期間沒有可用的抗體。提供非參檢驗P值（源數據，表S8）。

之前我們曾指出ALL患者在輸注CTL019後IL-6顯著升高出現嚴重CRS，可用IL-6受體阻斷抗體tocilizumab迅速逆轉。在這之前，1名患者（受試者03）接受糖皮質激素治療後成功逆轉CRS。對於後續患者，tocilizumab被納入對CLL患者嚴重CRS的處置。4例患者接受tocilizumab治療（有2名加用類固醇）後，得到迅速退燒，血壓回穩以及巨噬細胞活化相關的生化異常（鐵蛋白和CRP）迅速改善的效果。使用tocilizumab後鐵蛋白的生化指標列於圖S3中。

CTL019擴增的峰值與CRS的相關性，CRS與臨床應答的相關性（P<0.05）列在圖S4中。與沒有或者輕微CRS（0~1級）患者相比，有嚴重CRS（2~4級）的患者IL-6峰值水平更高（平均峰值， 269比34 pg/ml； P = 0.014），2~4級CRS患者的sIL-2R水平更高（平均峰值， 10962比4177 pg/ml； P =0.008），而血清中INF-γ和IL-2無明顯統計學差異(圖5和表S11)。輸注後1個月內的鐵蛋白（8例受試者）和CPR（5例受試者）數據有限，這阻礙了對CRS分級的權威性分析。CRS2~4級患者比CRS0~1級患者有更高峰值的鐵蛋白均值 21，502比1980)和C-反應蛋白（均值160比42)；儘管還有少數患者樣本沒有進行詳細的統計學分析，但這些有限的數據表明鐵蛋白和（或）C-反應蛋白可作為CRS活動和對治療有應答的生物標誌物。症狀和患者的具體特點不能對CRS進行預測，如年齡，治療史，遺傳風險和細胞劑量（表S5）.

所有接受tocilizumab治療CRS的患者在輸注tocilizumab時T細胞正在持續擴增。Tocilizumab使用後，症狀迅速改善，儘管至少給藥2次，在給藥後的幾天T細胞擴增達到頂峰，這表明Tocilizumab不能完全抑制T細胞的持續擴增。因為所有患者有持久存在的細胞，很顯然tocilizumab不會影響T細胞的長期存活。

與CRS相關的神經系統不良反應有5例患者，包括1或2級幻覺、意識模糊、高燒引發的譫妄，需ICU護理或藥物治療。出現1例持續2天的4度精神錯亂，這至少與T細胞治療部分相關。

B細胞再生障礙和低丙種球蛋白血症

B細胞再生障礙和低丙種球蛋白血症比較常見。全部獲得CR的患者和2例獲得PR的患者檢測不到B細胞。對CTL019沒有應答的患者不會出現B細胞再生障礙。根據免疫球蛋白水平靜脈注射足量的免疫球蛋白來處置低丙種球蛋白血症。在最初治療的患者中B細胞再生障礙持續了4年，進一步表明了持續存在的T細胞可保持功能。

討論

使用CAR改造的T細胞靶向癌症的研究已超過20年，但在初期受限於基因改造的T細胞在體內擴增能力低，持久性差。在早期報告中我們發現，CTL019在3例CLL患者體內有臨床活性。我們現在報告入選的18例患者中，總應答率為8/18，這些應答是持久的，並且獲得CR的患者沒有復發。不需要進一步治療就能持續清除惡性克隆。CTL019的高度擴增，長期的持久性以及輸注後數年的B細胞再生障礙都與應答響應相關。我們尚未發現對患者或疾病進行預先相關分析可以預測哪些患者最可能出現應答反應，儘管這項研究沒有涉及這項關聯的調查。接受治療的患者人數有限，但是獲得應答與沒有應答的患者在年齡，既往治療和遺傳風險因素之間沒有關聯。通過測定平均螢光強度，應答者與無應答者之間的CD19的表達水平沒有差異。T細胞劑量和應答之間沒有關聯，細胞製品也沒有顯著的特點可預測應答，如表型，體外抗CD19+靶標的活性或premanufacturing端粒長度。但是我們確定T細胞在體內擴增的水平和應答相關聯。另外，無應答者的CLL細胞在體外易受到裂解，為不應答是由於體內T細胞擴增受阻這一假設提供支持。

第二代CARs顯示了對CD19+淋巴瘤的強大活性，包括B細胞ALL，據報導成人和兒童ALL完全緩解率達66%到90%。在一些ALL患者中，CAR改造的T細胞在體內高度擴增，消除了大部分白血病負荷，在某些情況下能保持長期的持續性功能。目前還不清楚為什麼不同疾病完全緩解率不一樣。在我們機構，ALL和CLL使用的CTL019是一樣的。本組接受治療的CLL患者年齡往往大於ALL患者，並且CLL患者和ALL患者既往治療方案也不一樣。CLL和ALL患者的自體T細胞的活性可能會不同。CLL和ALL的腫瘤微環境很可能也不一樣。CLL患者局部免疫抑制的許多機制已被確定，包括T細胞識別白血病細胞無能，微環境中免疫抑制細胞因子的產生和免疫檢查點過表達，這些都會減弱和阻斷免疫反應。這些發現說明使用CTL019和免疫檢查點抑制劑或其他方法增強T細胞對腫瘤的識別很合適。

圖4：獲得CR的患者CTL019細胞的持續性和功能保持。（A）輸注12個月後流式細胞術（實心圓）和qPCR（實心三角）檢測CTL019的長期持續性。所得結果都高於流式細胞術限定值（0.1%）和qPCR的定量限定值（<25拷貝數/ mgDNA）。（B和C）在輸注後純化患者 UPCC04409-02外周血單個核細胞，與CD19 APC或對照抗原(間皮素)刺激6小時，並檢測檢查脫粒作用（CD107a）和細胞因子的表達。（B）等值線圖顯示 CD8+CAR-T細胞受到表達對照抗原或CD19 K562細胞刺激，CD107a相對於MIP-1b (上兩行) 或IL-2相對於IFN-g的表達(最下行)。(C)隨著時間的推移，CAR19+ CD8 T 細胞在CD19+ 靶細胞刺激下應答功能的概要圖。數據來源於（B），並且去除本子集本底頻率（源數據，表S9和S10）。

圖5：輸注後首月細胞因子峰值。（A到D）IL-6的峰值。(A)：IFN-γ (B)： IL-2受體拮抗劑 (IL-2RA) (C)：IL-2 (D)：CRS等級顯示。灰色符號代表無反應；黑色符號代表取得了完全或部分緩解。個位數表示CRS反應等級（1到4）。Wilcoxon rank-sum檢驗P值。缺少1例4級CRS獲得CR受試者的細胞因子值（n=13）。（源數據，表S11）。

與CAR-T細胞治療相關的最嚴重的毒性是CRS。CRS是全身性的炎症反應，由高度增殖和活化的T細胞產生的高水平的炎性細胞因子引起。CRS可能會是溫和的有自限性的症狀，包括發燒，肌肉痛，關節痛，食慾減退和疲勞。CRS可進展為嚴重的致命的併發症如高燒，低血壓，毛細血管滲漏，缺氧，血細胞減少和凝血功能障礙。腎功能不全很可能與低血壓相關。CTCAE評分標準只適用於靜脈滴注毒性，對CTL019治療後產生的CRS不適用。我們和其他人員開發的CRS評分標準對CAR-T治療引發的CRS產生的臨床參數有更好的體現。

CRS患者的臨床與生化指標與HLH或MAS一致。MAS臨床和生化指標的改變會伴有噬血現象，瀰漫性血管內凝血和血細胞減少症，這和我們治療ALL患者的經歷類似。在CRS高峰期至少採集一份骨髓樣本，可以看到噬血現象和CD163標記的巨噬細胞活化，鐵蛋白，CRP和sIL-2R顯著升高是MAS/HLH的標誌。2~4級CRS患者的鐵蛋白，CRP和sIL-2R峰值顯著高於0~1級CRS患者，且與嚴重CRS相關。這些改變的生化指標是有用的診斷標誌物，但不用於確定是否對CRS進行幹預；CRS的治療只基於臨床表現。其他研究者也觀察到在ALL患者的CRS中CRP的升高，並指出CRP將預測CRS的進展。雖然收集的數據有限，但它表明鐵蛋白和/或 CRP可作為CRS和對治療應答的生物標誌物，而不需要不常用的檢測方法如對IL-6水平和對CAR改造的T細胞的檢測。

CAR-T細胞直接相關的神經系統不良反應不常見。在5例患者中與CRS並發的神經系統不良反應由6項紀錄，包括可逆性的1或2級幻覺，精神錯亂或與高燒相關的譫妄，一般可通過ICU護理，鎮靜治療或其他藥物治療。有1例患者發生3級CRS並持續了2天高燒相關的可逆性4級精神錯亂，對其進行了ICU護理和鎮靜催眠治療。在這期間對患者進行了計算機斷層掃描，未發現明顯異常。在其他研究中發現了更嚴重的CAR-T治療相關性神經系統併發症，尤其是在ALL和NHL患者中，包括嚴重遲鈍，腦病和癲癇發作。

神經毒性的病因尚不清除，但作者推測它可能與T細胞活化和細胞因子水平增高有關。目前還不清楚CLL患者的毒性和ALL和NHL患者是否不同；在發生CRS的少數接受治療的患者中可發現有限的神經毒性反應。在出現和沒有出現神經系統症狀的患者腦脊液中可發現CAR-T細胞，這表明CAR-T細胞不會直接造成神經毒性。中樞神經系統毒性也與其他T細胞增強治療相關，例如blinatumomab，為T細胞活化可導致神經系統不良反應這一概念提供支持。

有4例患者的CRS為自限性，5例患者血流動力學紊亂，包括低血壓和缺氧，需要進行幹預。高劑量糖皮質激素對1例嚴重CRS患者對有效。這例患者讓人關注，雖然輸注CTL019後獲得了部分緩解，但在使用類固醇後檢測到了T細胞丟失。在治療後續的CLL患者之前，我們觀察到1例兒童ALL患者IL-6顯著升高並且發生嚴重CRS。該患者接受抗-IL-6受體拮抗劑tocilizumab治療，嚴重CRS迅速得到改善，並且T細胞沒有受到損失。因此在隨後的患者中，使用tocilizumab被納入了對CRS的處置。未來的研究可進一步確定CRS的預測因子，tocilizumab使用的最佳時機，替代抗細胞因子療法的作用和是否可以對CRS進行預處理。我們的數據顯示即使在使用tocilizumab症狀改善後，T細胞依然可以擴增，至少在一些患者中是這樣（數據未指明）。例如12號受試者，在使用tocilizumab5天後測到T細胞擴增高峰，儘管不是每天進行檢測。在另一個案例中（22號受試者），在tocilizumab使用當天測到T細胞初次擴增高峰，然後降低，在第28天再次擴增。這2例患者都出現了應答。在使用tocilizumab後這些細胞能否保持功能尚不可知。我們希望在未來能收集更多的數據來證明使用tocilizumab和其他IL-6拮抗後對T細胞增殖的後續活力的影響。目前我們數據的另一個局限就是，還不清楚預防性使用IL-6拮抗劑是否能防止CRS，以及這是否會對臨床抗腫瘤效應產生不良影響。

獲得CR並出現B細胞再生障礙和低丙種球蛋白血症的患者，可通過靜脈注射飽和劑量的丙種球蛋白來處置。1例患者獲得緩解，在輸注21月後死於傷口假單胞菌感染引發的膿瘡壞疽併發症。他曾接受靜脈注射免疫球蛋白來治療低丙種球蛋白血症；目前還不清楚是B細胞再生障礙還是的丙種球蛋白血症導致了他的死亡，但我們提議對所有接受CAR-T治療的低丙種球蛋白血症患者都需要靜脈注射飽和劑量的免疫球蛋白。

我們試圖找出入選的沒有經過有效治療的高死亡風險的CLL患者。共有10名患者沒有獲得CR，在輸注後的1到10個月中疾病進展或死亡，這為晚期和高風險患者提供了一個佐證。儘管出現了許多令人振奮的治療CLL新藥，但能出現完全應答的很少見，並且會如預期一樣進入進展期；對新的更有效的療法有迫切的需求。值得注意的是，我們的數據顯示，一些患者通過一次CTL019治療便可獲得深度持續性緩解。是否可以利用CTL019治療更早期的腫瘤患者，或CTL019聯合其他療法如免疫調節，來提高臨床應答和遠期療效仍待待確定。

細胞長期可持續性能否超過4年尚不清楚；長期隨訪的患者數量有限，並且我們不清楚如果CTL019消失會不會引起CLL復發。從我們治療CLL和ALL經驗來看，T細胞的持久性和白血病的無病生存率呈正相關。最終，我們需要更多的長期隨訪的患者來確定是否CTL019可以完全消除CLL，CAR-T細胞能否被不同的方法消除。這一方法的局限是需要從經過多次治療的患者身上採集足夠量的T細胞，並且要花費2~3周來製備CTL019。在此期間患者必須保持臨床穩定以便接受治療，並且如圖S1高亮標出，有些患者想要接受治療但卻不合適這種療法。

在一部分患者中CTL019清除白血病克隆的能力表示達到深度緩解，這使CTL019有別於其他靶向藥物如ibrutinib和idelalisib，MRD的根除只出現在異基因造血幹細胞移植後，說明這可能是治療白血病的唯一方式，儘管非復發死亡率還很高。CTL019能否最終治癒CLL還要通過更久的隨訪來判斷。CTL019治療CLL的劑量優化研究正在進行，繼續研究來明確產生應答的機制也很有必要。

材料和方法

研究的設計與監管

成人年滿18周歲，至少經過2次治療方案後失敗的復發性或難治性CD19+CLL患者；最後一次二線化療和進展之間不超過2年，不適合或主動放棄異基因造血幹細胞移植。如果之前的治療方案中沒有獲得CR或者治療後不足2年疾病進展，17p染色體缺失或TP53突變的高危患者亦可入選。腫瘤重新分期後，單採收集外周血T細胞用於製備CTL019。受試者均給予一個療程的常規化療進行淋巴細胞刪除，在細胞輸注前4天完成。淋巴細胞刪除性化療包括CLL常規治療方案和主治醫師自行選擇方案。這項試驗的主要目的是確定治療的安全性和從分離患者血液製備CTL019的可行性。次要目的包括評價輸注的基因修飾的T細胞功能和持久性，應答率，患者生存率和其他相關點。該方案通過賓夕法尼亞大學倫理審查委員會，美國食品和藥品監督管理局（FDA）和重組DNA諮詢委員會批准，並在FDA批准的新藥研究申請下進行。按照赫爾辛基宣言所有患者給予知情同意。 這項研究已在ClinicalTrials.gov上註冊(標識號NCT01029366)。

隨訪截止2014年12月31號。所有作者討論解釋了研究結果，並對數據進行了證實和分析。所有圖的源數據補充材料可提供(表S6到S11)。

載體生產

CD19-BB-ζ轉基因(GeMCRIS 0607-793)的設計與構造已作介紹。慢病毒載體按照目前Lentigen公司或費城兒童醫院三質粒製作方法的生產程序製備。

T細胞採集和CTL019細胞代數

通過白細胞分離收集自體T細胞，通過CD3和CD28單抗磁珠刺激T細胞。用抗-CD19 scFv連接4-1BB和CD3-ζ信號域的慢病毒載體轉染T細胞，並在體外擴增10~12天。平均轉染效率20.1%（範圍4.7%到39.2%）。產品標準之前已介紹。

應答評估

在方案設定的時間點，並基於國際研討會CLL組客觀影像學評價療效標準，完成疾病反應的評估。此外用深度測序分析進行MRD研究性評估。

相關性研究

如上所述，進行了樣本處理，流式細胞術，細胞因子和細胞因子受體分析，qPCR分析。此外還進行了以下研究。

免疫球蛋白重鏈重排的下一代測序。利用iPrep(Invitrogen)從製備的細胞產品和輸注後外周血中提取基因組DNA。對IGH位點的第三互補決定區進行擴增，並利用特異性引物和插入基因片段進行深度測序(Adaptive Biotechnologies)。利用免疫組化SEQ對序列數據進行審查。每例患者的白血病克隆經過基準校正，並通過隨訪患者的骨髓和外周血樣本來評估白血病克隆對CTL019的應答。每個樣本檢測值都建立統一獨立的編碼，並對每個樣本白血病克隆頻率進行計算。

IGHV突變狀態。在輸注CTL019之前，收集外周血提取基因組DNA，用來評估IGHV位點的突變狀態(Cancer Genetics公司)。

多色流式細胞術

抗體。購買使用對應下列抗原的抗體：(i)購自eBioscience：CD3異硫氰酸螢光素（FITC），CD8藻紅蛋白（PE）和花青5.5 PE（Cy5.5PE），CD14 Cy7PE，CD16 Cy7PE，CD5別藻藍蛋白（APC），CD19 Cy7PE和APC， CD20 FITC， CD45 PE， CD10 Cy7PE， CD34 Cy7PE， andTNF-α Alexa Fluor 700；(ii)購自BioLegend：CD4亮紫羅蘭色605 (BV605)和BV785， CD8Cy5PE， D45ROBV570以及 IFN-γBV570；(iii)購自Becton Dickinson：CD14 V500， CD3 BV605， IL-2 CF594PE， CD107a Cy5PE， 粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子BV421以及巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-1b PE；(iv)購自Beckman Coulter：CD27 Cy7PE； (v) 購自R&Dsystems：MIP-1a FITC。用Alexa Fluor 47-conjugatedmAb來檢測CAR19 分子已作介紹。研究中所有用到的抗體在使用前都進行了滴定。如前所述，CTL019的擴增與持久性和CLL細胞的例行評估，都是用4色6參數的Accuri C6流式細胞儀進行檢測。

CTL019抗-CD19活性。為評估對CD19+靶細胞的響應，將輸注的製品和輸注後的樣品分別加入含有莫能菌素，布雷菲德菌素A和抗-CD107a Cy5PE單抗的表達CD19+的K562細胞中，在37℃下孵育6小時。分別用表達間皮素K562細胞和PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯）/離子黴素作陰性和陽性對照。用死細胞去除染料Aqua Blue（Invitrogen公司）對細胞進行染色，再進行表面染色。然後用Cytofix/Cytoperm和Perm/Wash (BD)進行固定和透化處理，再用抗細胞因子抗體染色。用18色20參量LSR Fortessa流式細胞儀在405，488，532和628納米波長下檢測細胞。使用FlowJo（第10版）對數據進行分析。

CTL019的管理

淋巴細胞刪除性化療應在CTL019輸注的前4天左右結束。細胞通過靜脈輸注，按照3天分散劑量方案（第0天10%，第1天30%，第2天的60％），共有1 × 109到5 × 109 CD3+細胞，至少含有1.5 × 107 CTL019細胞。進行第1或第2天的輸注是為了觀察發燒或其他毒性。患者接受了為期3天的分量輸注方案的全部細胞製品，即使低於目標劑量也會有效。根據最初的設計方案，在允許的情況下患者在第10天可以獲得額外一次T細胞輸注，只有1例患者（03號受試者）接受了這一輸注，其他受試者沒進行過第10天額外的T細胞輸注。對受試者按計劃進行毒性評估（1個月的每周評估，6個月的每月評估，以後每3個月評估），在第1個月，第3個月以及以後每3個月對受試者進行應答評估。

毒性分級

根據通用毒性標準（CTC）3.0版對CTL019輸注後毒性進行分級。CTC對CRS分級參照抗體治療的急性輸液反應等級，它不足以描述細胞治療的後發性或正在發生的CRS。我們制定了一個改良型CRS分級標準，用來表述不良反應的嚴重程度，並幫助確定是否需要進行醫療幹預。修訂後的CRS分級標準見表S4，A和B。

統計分析

描述統計學的計算來對變量進行研究。數據以±SD或連續變量（最小值~最大值）和分類變量（n%）的平均數呈現。最準的整體反應率以研究期間精確到95%CI受試者CR和PR的比例來計算。為總生存期和PFS終點預估Kaplan-Meier 曲線和中位生存期。總生存期是指從輸注到死亡的時間，截止到最後一次隨訪或2014年12月31號。10號受試者例外，他初次治療沒有應答，並接受了第二次CTL輸注（佔60%），他是從第1次輸注2個月後的第二次輸注開始計算。疾病進展通過標準規範確定，PFS指第一次輸注到疾病進展或死亡這段時間。CR和PR的定義已作說明。每例患者，用流式細胞術檢測CD3陽性細胞中表達抗-CD19 CAR-T細胞比例，用qPCR測定基因改造的T細胞數（平均標記每個細胞），並分別對時間作圖，以確定CTL019的擴增和持久性。用峰值（即最大值）確定擴增的水平，CTL019檢測結果大於檢測下限（CD3 CAR+百分比0.1%，qPCR：25 copies/mg DNA）來檢測CTL019細胞的持久性。使用Wilcoxon rank-sum檢驗，CRS等級和總體反應與擴增水平相關。用散點圖和Wilcoxon rank-sum檢驗，通過CRS等級(0到1與2到4)，對細胞因子水平和輸注後的第一個月預先選定的4種細胞因子(IL-6， IFN-g， IL2-RA和IL-2) 峰值的差異進行比較。第一月被評為CRS的相對高發期。

適當情況下，在0.05顯著水平上，用雙邊非參數檢驗（如Wilcoxon rank-sum檢驗）進行組之間的統計對比。用R 3.0.1 (R核心開發小組) 或 Stata 13.0 (StataCorp)進行統計學分析。

英文原文：Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia

原作：David M. Porter.

轉載請標明出處： 愛康得生物醫學技術（蘇州）有限公司醫學轉化部高級經理Paul Hsu原創編譯

【相關會議推薦】

本次會議將聚焦CAR-T技術發展的最前沿，匯集國內CAR-T領域的著名專家、團隊帶頭人、一線臨床醫生共同商討CAR-T技術研究和應用的最新動態，促進學術交流，打通科研與臨床之間的通道，緊跟國際研究動態，發揮我國臨床資源豐富的優勢，推動CAR-T技術更好、更快地發展。

愛康得生物醫學技術（蘇州）有限公司，是一家專注於腫瘤治療領域高新技術開發及其產業化的生物醫學公司。核心團隊由多名來自如M.D.Anderson、University of California、University of Oklahoma、Wollongong University和蘇州大學等國內外著名高校的抗體工程專家、免疫學專家、病毒學專家、分子生物學家、臨床醫生以及具備豐富企業管理和資本運作的管理人員組成。公司技術團隊已經掌握CAR-T核心技術，可為全球科研工作者和醫生提供成套CAR-T科研服務，可在短時間內為客戶構建具有功能的CAR-T細胞。

(生物谷Bioon.com)