Exosome-Mediated Activation of Toll-LikeReceptor 3 in Stellate Cells Stimulates Interleukin-17 Production by CD T Cellsin Liver Fibrosis
作者：Wonhyo Seo, Hyuk Soo Eun, So Yeon Kim, Hyon‐Seung Yi, Young‐Sun Lee, Seol‐Hee Park, Mi‐Jin Jang, Eunjung Jo, Sun Chang Kim, Yong‐Mahn Han, Keun‐Gyu Park, Won‐Il Jeong. (Laboratory of Liver Research, Biomedical Science and Engineering Interdisciplinary Program, Laboratory of Liver Research, GraduateSchool of Medical Science and Engineering).
發表情況：Hepatology 2016, 64:616‐631, doi: 10.1002/hep.28644.
在肝損傷中，HSC中外泌體對肝纖維化產生什麼作用，並且如何發揮作用還未清楚。
明確了在肝損傷中，HSC中外泌體介導的TLR3激活通過增強γδT細胞產生IL-17A來加劇肝纖維化；
證明了固有的γδT細胞是肝纖維化早期IL-17A的主要來源，這反映了γδT細胞與TLR3介導的產生IL-17A的HSC之間的相互作用；
證實了將IL-17A與IL-23和IL-1β結合可通過增加轉錄因子RORγt的表達可以增強γδT細胞中IL-17A的產生；
信號轉導和轉錄激活因子3，細胞外信號調節激酶1/2和p38激活，生成的IL-17A也會強烈刺激HSC中的α-SMA，TGF-β，IL-6和膠原蛋白表達。
在肝損傷期間，肝細胞分泌的外泌體包括各種類型的自身RNA。最近，人們發現非編碼RNA是Toll樣受體3（TLR3）的激活劑。但是，肝外泌體和TLR3在肝纖維化中的作用尚未完全了解。一次或兩周注射四氯化碳（CCl4）導致急性肝損傷和早期肝纖維化後），主要在野生型（WT）小鼠的肝γδT細胞中檢測到白介素（IL）-17A產量增加。然而，與野生型小鼠相比，TLR3基因敲除（KO）小鼠的肝纖維化和γδT細胞產生的IL-17A均顯著減弱。更有趣的是，產生IL-17A的γδT細胞與活化的肝星狀細胞（HSC）緊密接觸，這表明HSC在γδT細胞產生IL-17A的過程中發揮了作用。用CCl4衍生的外泌體進行體外治療經過處理的肝細胞顯著增加了WT HSC中IL-17A，IL-1β和IL-23的表達，但並未顯著增加TLR3KO HSC中的表達。此外，與外泌體處理的WT HSC或經TLR3激活的WT HSC的條件培養基共培養後，γδT細胞的IL-17A產量大大增加。但是，當將γδT細胞與經IL-17A KO或TLR3 KO小鼠經外泌體處理的HSC共培養時，未發現類似的增加。通過在WT和TLR3 KO小鼠之間進行雙向骨髓移植，我們發現HSC中TLR3缺乏導致γδT細胞產生IL-17A的減少以及肝纖維化。結論在肝損傷中，HSC中外泌體介導的TLR3激活通過增強γδT細胞產生IL-17A來加劇肝纖維化，這可能與受損肝細胞中未知的自身TLR3配體刺激HSC有關。因此，TLR3可能是肝纖維化的新型治療靶點。
During liver injury, hepatocytes secreteexosomes that include diverse types of self-RNAs. Recently, self-noncoding RNA hasbeen recognized as an activator of Toll-like receptor 3 (TLR3). However, theroles of hepatic exosomes and TLR3 in liver fibrosis are not yet fullyunderstood. Following acute liver injury and early-stage liver fibrosis inducedby a single or 2-week injection of carbon tetrachloride (CCl4), increasedinterleukin (IL)-17A production was detected primarily in hepatic cd T cells in wild-type (WT) mice.However, liver fibrosis and IL-17A production by cd T cells were bothsignificantly attenuated in TLR3 knockout (KO) mice compared with WT mice. Moreinterestingly, IL-17A-producing cd T cells were in close contact with activatedhepatic stellate cells (HSCs), suggesting a role for HSCs in IL-17A production bycd T cells. In vitro treatments with exosomes derived from CCl4-treatedhepatocytes significantly increased the expression of IL-17A, IL-1b, and IL-23in WT HSCs but not in TLR3 KO HSCs. Furthermore, IL-17A production by cd T cellswas substantially increased upon co-culturing with exosome-treated WT HSCs orconditioned medium from TLR3- activated WT HSCs. However, similar increaseswere not detected when cd T cells were co-cultured with exosome-treated HSCsfrom IL-17A KO or TLR3 KO mice. Using reciprocal bone marrow transplantationbetween WT and TLR3 KO mice, we found that TLR3 deficiency in HSCs contributedto decreased IL-17A production by cd T cells, as well as liver fibrosis.Conclusion: In liver injury, the exosome-mediated activation of TLR3 in HSCsexacerbates liver fibrosis by enhancing IL-17A production by cd T cells, whichmight be associated with HSC stimulation by unknown self-TLR3 ligands fromdamaged hepatocytes. Therefore, TLR3 might be a novel therapeutic target forliver fibrosis.
圖1 TLR3缺乏會減弱CCl 4誘導的小鼠肝纖維化
通過注射CCl4 4周或BDL 3周誘導肝纖維化。（A）測量血清ALT，AST，TGF-β1和IL-17A的水平。（B）肝切片用天狼星紅溶液和α‐SMA抗體染色。（C）對全肝組織和分離的HSC進行qRT-PCR分析。（D）通過蛋白質印跡評估蛋白質表達。（E）在用BDL治療的小鼠中測量血清ALT，AST，總膽紅素和IL-17A的水平。（F）肝切片用天狼星紅溶液和α‐SMA抗體染色。數據表示為平均值±SEM。* P <0.05，** P <0.01，相對於相應的對照。比例尺= 200μm。
圖2 TLR3基因的消除會降低小鼠纖維化肝中γδT細胞的IL-17A產生
通過CCl4注射4周誘導WT和TLR3 KO小鼠的肝纖維化。（A，B）分離的肝MNC接受了FACS分析和PCR分析。（C）將切片的肝組織用IL-17A抗體染色，並在×100放大倍數下對五個隨機選擇區域的陽性細胞（棕色）進行計數。（D）用佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯（50 ng / mL）和離子黴素（500 ng / mL）重新刺激分離的肝MNC 5小時，並用IL-17A抗體染色。染色細胞進行FACS分析。數據表示為平均值±SEM。* P <0.05，** P <0.01，相對於相應的對照。比例尺= 100μm。
圖3 肝γδT細胞對急性肝損傷產生初始IL-17A，從而刺激CD4 T細胞中IL-17A的產生
用單劑量CCl4（0.4 mL / kg）給予WT，TLR3 KO和TCRδKO小鼠急性肝損傷。（A）測量血清ALT和IL-17A水平。（B，C）分別對WT和TLR3 KO小鼠的分離的肝MNC進行FACS分析和PCR分析。（D）用FACS分析了來自WT和TCRδKO小鼠的分離的肝MNC的產生IL-17的細胞。（E）進行WT和IL-17A KOγδT細胞向TCRδKO小鼠的過繼轉移，並分離肝MNC並用FACS分析。（F）分離的肝MNC進行PCR分析。數據表示為平均值±SEM。* P <0.05，** P <0.01與相應的對照。
圖4 存在IL-1β和IL-23時，外泌體介導的HSC的IL-17A產生增強了γδT細胞的IL-17A產生
（A）在2周CCl4誘導的WT小鼠肝纖維化中，遷移的表達eGFP的γδT細胞的FACS分析和免疫染色。（B）對來自急性受傷和纖維化肝的新鮮分離的HSC進行qRT-PCR分析。（C）CCl4介導的肝外泌體的分離和鑑定。測量了ALT和AST的水平，並觀察了CCl 4處理的肝細胞的形態變化。用動態光散射系統鑑定了分離的外泌體。（D）孤立的外泌體（1×10 9顆粒）用DiI染色，WT HSC用外泌體處理24小時，（E）外泌體處理的HSC用qRT-PCR分析。（F）用或不使用IL-1β（10 ng / mL），IL-23（50 ng / mL）和IL-17A（10 ng / mL）處理WTγδT細胞。對經過3小時處理的WTγδT細胞進行qRT-PCR，在3小時細胞因子處理後更換培養基後12小時測量了IL-17A的上清液水平。數據表示為平均值±SEM。* P <0.05，** P <0.01，相對於相應的對照。比例尺= 100μm。
圖5 TLR3介導的HSC的IL-17A產生會放大γδT細胞的IL-17A產生
（A，B）WT或TLR3 KO HSCs用肝外泌體和poly I：C（50μg/ mL）處理，然後進行qRT-PCR分析。（C）WT或TLR3 KOγδT細胞直接用poly I：C或經poly I：C處理的WT，TLR3 KO和IL-17A KO HSC的條件培養基處理6小時。（D，E）WTγδT細胞分別用細胞因子或來自聚I：C處理的WT和TLR3 KO HSC的條件培養基處理3小時。（F）使用具有3μm孔的Transwell支撐物評估WTγδT細胞向HSC的遷移。WT或TLR3 KO HSC（1×10 5個細胞）與WTγδT細胞（2×10 6個細胞）在有或沒有多聚I：C處理的情況下共培養24小時。數據表示為平均值±SEM。* P<0.05，** P <0.01，相對於相應的對照組。
圖6 HSC中的TLR3與肝纖維化和損傷中γδT細胞的IL-17A產生有關
向WT，TLR3 KO，TL-17A KO和TLR3 / IL-17A DKO小鼠注射CCl42周。（A）肝切片用天狼星紅溶液和α‐SMA抗體染色以分別檢測膠原蛋白積累和HSC活化。（B）測量血清IL-17A水平。（C）對全肝組織進行qRT-PCR分析。（D）將表達GFP的WT骨髓移植到WT小鼠後的第8周。評估肝淋巴細胞的嵌合性。為了證實嵌合，還對分離的HSC和肝MNC進行了PCR分析。然後，向所有嵌合小鼠注射單劑量（0.4 mL / kg）的CCl4，並在CCl4後12小時處死注射。（E）注射CCl4後在嵌合小鼠中分析產生IL-17A的γδT細胞。（F）分別在肝MNC和嵌合小鼠血清中評估IL-17A的表達水平。數據表示為平均值±SEM。* P <0.05，** P <0.01，相對於相應的對照。比例尺= 200μm。
圖7 人類HSC中的TLR3與人類γδT細胞的IL-17A產生有關
（A）將20mM CCl 4處理過的Hep3B和人類胚胎幹細胞衍生的肝細胞（hES-Hep ）分離的外泌體與LX-2和hTert共培養24小時。（B）經外泌體處理的LX-2和hTert進行qRT-PCR分析。（C）用Hep3B或poly I：C（50μg/ mL）的外泌體處理有或沒有TLR3 siRNA的LX-2，然後進行qRT-PCR分析。（D）IL-17A處理後，hγδT細胞經過qRT-PCR分析。（E）用幾種IL-1β（10 ng / mL），IL-23（50 ng / mL）和IL-17A（50 ng / mL）的組合處理hγδT細胞。hγδT細胞進行了qRT-PCR分析。（F）HSC和γδT細胞之間固有的IL-17A擴增環的機制。數據表示為平均值±SEM。* P<0.05，** P <0.01，相對於相應的對照組。比例尺= 50μm。
在本研究中，其結果表明，HSCs中外泌體介導的TLR3激活通過肝纖維化早期階段IL-17A，IL-1β和IL-23的產生觸發γδT細胞產生強大的IL-17A。此外，外泌體介導的TLR3激活增加了HSC中CCL20的表達，從而導致CCR6 + γδT細胞的募集。因此，發現表明，TLR3可能是改善肝纖維化的新型治療靶標，需要進行肝外體篩查以治療和診斷肝纖維化。