慢性阻塞性肺病(COPD)大鼠模型的建模方法

來源：吸菸致慢性阻塞性肺病

模式動物品系：SPF級SD大鼠，健康，3-4W，雄性，體重為190-230g。

實驗分組：實驗分兩組：正常對照組和模型組。

實驗周期：4 weeks

建模方法：

1. 第1天、第14天將大鼠用乙醚吸入麻醉後，暴露喉頭，以靜脈套管針替代氣管導管行氣管插管，向大鼠氣管內注入200 μg/kg（200 μg/ml溶於生理鹽水中） LPS（lipopolysaccharide，脂多糖），完畢後將大鼠直立旋轉10-20s，使LPS均勻分布於肺部。 2. 第2-13天，15-28天，每天在有機玻璃密閉箱（70×60×60cm3）持續吸入新鮮的香菸霧45min，15支/天，使密閉箱煙霧濃度約為100-120 mg/m3。每天燻煙後立刻用低於環境溫度（20℃）5℃冷空氣刺激1小時，造模28天結束。

應用：疾病模型

模型評價 1. 觀察各組大鼠的活動量、毛髮、食量、呼吸、體重等。每周給食前1h稱重，觀察體重的變化。 2. RT-qPCR檢測 收集大鼠PBMC和肺組織，提取RNA，利用RT-PCR檢測Foxp3、RORγT的表達。 3. Western blot檢測 收集大鼠PBMC和肺組織，提取蛋白，採用western-blot檢測TAZ水平。 4. 流式細胞檢測外周血T淋巴細胞亞群 收集各組大鼠腹主動脈血2ml左右，利用大鼠外周血淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞（PBMC）細胞懸液。 （1）檢測Th17時，細胞懸液加入佛波酯（50ng/ml）、離子黴素（1μg/ml）和莫能菌素（2μmol/L），37℃、5%CO2培養箱終培養6h後，反覆洗滌3次後100μL PBS重懸，然後加入CD4單克隆抗體10μL，混勻後4℃避光孵育30min，洗滌、固定、破膜，再加入IL-17單克隆抗體10μL，4℃避光孵育20min，反覆洗滌後PBS重懸為500μL/管，樣品置流式細胞儀檢測CD4+IL-17+細胞佔CD4+T細胞的比例。 （2）檢測Treg細胞時，細胞懸液先加入CD4、CD25單克隆抗體各10μl，混勻後4℃避光孵育30min，洗滌、固定、破膜，再加入FoxP3單克隆抗體10μL，4℃避光孵育20min，反覆洗滌後PBS重懸為500μL/管，樣品置流式細胞儀檢測CD4+CD25+FoxP3+細胞佔CD4+T細胞的比例。

組織病理學 HE染色：右肺葉組織固定包埋切片，HE染色，觀察肺組織病理變化情況。

標誌因子水平 ELISA檢測： 檢測血清和支氣管肺泡灌洗液中的IL-17和IL-10水平。 支氣管肺泡灌洗液（BALF）抽取方法：大鼠取血後，開胸，分離縱膈，注射器抽取3ml生理鹽水從氣管插管推入肺中，每次反覆灌洗3次後抽出灌洗液，肺泡灌洗液以4℃ 3000r/min離心15min，取上清。 血清提取方法：將收集於血清分離管中的全血標本在室溫放置 2 小時或 4oC 過夜，然後 1,000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，將上清置於-20oC 或-80oC 保存，避免反覆凍融。