Nature | 膜內分子伴侶複合物協助膜蛋白的生物合成

撰文 | 十一月

責編 | 兮

在真核生物中大約25%的蛋白質編碼基因編碼細胞所必須的膜蛋白【1】。膜蛋白最主要插入、被修飾以及摺疊的細胞器是內質網。但是過去幾個世紀關於膜蛋白是如何靶向內質網以及跨膜結構域是如何插入磷脂雙分子層的研究還未見定論【2】。

為了對該問題進行解析，2020年8月19日，英國劍橋MRC分子生物學實驗室Ramanujan S. Hegde研究組發文題為An intramembrane chaperone complex facilitates membrane protein biogenesis，發現了包含保守的內質網膜蛋白CCDC47以及Asterix在內的異源二聚體PAT複合物以及其在協助膜蛋白生物合成中的重要作用。

多次跨膜蛋白具有很多功能比如跨膜運輸、細胞內相互作用以及細胞表面受體等等【3】。這些功能中的一些可能需要蛋白的跨膜結構域不僅僅作為簡單的膜錨定區域發揮作用。比如說受體蛋白或者轉運蛋白需要跨膜結構域特定的親水表面來協助蛋白發揮生理功能【3】。因此，多次跨膜蛋白的跨膜結構域具有多種不同的長度、序列特點以及生物物理性質。當跨膜蛋白被摺疊時，多次跨膜蛋白的跨膜結構域通常會被包裹在內使其親水性區域彼此面對，而向周圍磷脂雙分子層呈現出一個幾乎不受幹擾的疏水性表面【4,5】。但是半親水性的跨膜結構域是如何在膜內保持穩定直到末端跨膜結構域裝配完全的還不得而知【2】。

圖1 GPCRs七次跨膜結構域示意圖

為了找到協助跨膜蛋白生物合成的相互作用的分子伴侶，作者們對G蛋白偶聯受體GPCRs生物合成過程中不同階段中間產物的相互作用伴侶進行鑑定。GPCRs是一大類跨膜蛋白，具有七次跨膜結構域（圖1）。作者們對牛視紫紅質GPCR蛋白的前兩個跨膜結構域（transmembrane domains，TMD）進行標記並以正確的朝向插入內質網來源的粗面微粒體（Microsomes）中（圖2）。翻譯停滯的複合物中包含不同長度的新生多肽，可以通過在跨膜結構域TMD1區域引入的半胱氨酸（圖2）與鄰近的蛋白發生相互作用，可以用該方法「釣到」協助跨膜蛋白生物合成的分子伴侶。在早期階段（TMD1產生和插入的階段），半胱氨酸交聯主要釣取到的是與核糖體相關蛋白。其中並未發現EMC（ER membrane protein complex）複合物幫助TM1插入內質網，可能是由於該相互作用比較短暫，所以未被半胱氨酸交聯的方法捕獲。隨後TMD2從核糖體中逐漸出現，作者們發現出現了一個大約10kDa的蛋白質交聯信號，作者們認為這可能是先前研究【6】中提到的「與內質網易位子相關的10kDa的蛋白」（Protein associated with the ER translocon of 10 kDa），所以作者們將該蛋白命名為PAT10（圖3）。另外，作者通過對TMD1-PAT10複合物進行蔗糖梯度離心發現其總分子量大於100kDa，這給了作者一個提示PAT10是可能是一個較大的複合物的中的一部分，該複合物隨後被稱為PAT複合物。

圖2 牛視紫紅質前兩個跨膜結構域示意圖

圖3 哺乳動物視紫紅質跨膜結構域跨膜示意圖

為了鑑定出PAT複合物中的包含的組分，作者在非變性的條件下對交聯反應進行溶解將核糖體中新生的肽鏈釋放，通過對Flag標記進行蛋白親和純化對共同純化下來的蛋白進行質譜分析。其中有六個蛋白相對於對照組來說富集程度超過兩倍：Sec61α、Sec61β、Calnexin、Galectin7、SPP以及CCDC47。其中Sec61α、Sec61β以及SPP能與新生肽鏈發生直接相互作用。在剩下的候選蛋白中，CCDC47引起了作者的注意，因為通過CCDC47的抗體可以直接通過生化實驗證明CCDC47與PAT10的相互作用而其他的比如SPP蛋白並不能通過抗體檢測出相互作用。而且在微粒體中也發現新生的蛋白中富集CCDC47，在微粒體中敲除CCDC47後這種富集會消失。這些結果說明CCDC47與膜蛋白發生相互作用，該作用是特異性的並且是PAT複合物的一個非常穩定的組分。

另外，作者還發現兩種抗CCDC47抗體的生化實驗發現了CCDC47的相互作用蛋白Asterix。通過Asterix抗體可以特異性的檢測到與PAT10的相互作用。值得注意的是，CCDC47與Asterix不僅僅可以發生相互作用，更重要的是兩者形成了一種專性複合體，敲低或者敲除兩者之一後另外一個也會受到影響。因此，作者們最終確認PAT複合物的組分是CCDC47以及Asterix。

圖4 PAT複合物在膜上發揮分子伴侶功能的模式圖

那麼PAT複合物是如何影響膜蛋白的呢？使用siRNA對PAT複合物進行敲低後作者發現對尾錨定蛋白SQS幾乎沒有影響但是五種GPCRs的生物合成都出現了明顯地降低，說明PAT複合物對於多次跨膜蛋白的優化生物合成是非常重要的。通過對跨膜結構域中的胺基酸進行置換，作者發現親水性的TMD會與PAT複合物相互結合協助其進入磷脂雙分子層。另外，通過對β1AR成熟摺疊的蛋白以及蛋白短截片段作為不完全摺疊蛋白進行檢測會後，作者發現PAT複合物會釋放摺疊完全的蛋白底物。

總的來說，Hegde研究組的工作發現PAT複合物作為在內質網存在的分子伴侶複合物直接與新生蛋白的跨膜結構域發生相互作用，在底物蛋白正確摺疊後會被釋放，該過程對於膜蛋白的優化合成是非常關鍵的。因此，Hegde研究組的工作揭開了跨膜蛋白在最終形成穩定摺疊結構過程中促進跨膜結構域的正確裝配的分子伴侶。

原文連結

https://doi.org/10.1038/s41586-020-2624-y

製版人：琪醬

參考文獻

1 UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic acids research 45, D158-d169, doi:10.1093/nar/gkw1099 (2017).

2 Shao, S. & Hegde, R. S. Membrane protein insertion at the endoplasmic reticulum. Annual review of cell and developmental biology 27, 25-56, doi:10.1146/annurev-cellbio-092910-154125 (2011).

3 von Heijne, G. The membrane protein universe: what's out there and why bother? Journal of internal medicine 261, 543-557, doi:10.1111/j.1365-2796.2007.01792.x (2007).

4 Lu, P. et al. Accurate computational design of multipass transmembrane proteins. Science (New York, N.Y.) 359, 1042-1046, doi:10.1126/science.aaq1739 (2018).

5 Venkatakrishnan, A. J. et al. Molecular signatures of G-protein-coupled receptors. Nature 494, 185-194, doi:10.1038/nature11896 (2013).

6 Meacock, S. L., Lecomte, F. J., Crawshaw, S. G. & High, S. Different transmembrane domains associate with distinct endoplasmic reticulum components during membrane integration of a polytopic protein. Molecular biology of the cell 13, 4114-4129, doi:10.1091/mbc.e02-04-0198 (2002).