一、細胞復甦
1) 提前準備完全培養基並預熱至37℃（可以放至在水浴或培養箱中進行預熱，需要多少預熱多少，反覆預熱會導致培養基失活）；用清洗潔淨的燒杯或其他合適容器裝有適量超純水，然後放入37-38℃水浴鍋中預熱至37℃（至少需30min）；把所需耗材和其他物品放置於超淨工作檯中紫外照射滅菌；
2) 提前查詢所取凍存管的存放位置，把整個存儲架子提起，為了降低復溫對其它細胞的影響，可把該存儲架子放置於裝有液氮的泡沫盒中，快速（存儲架離開液氮罐的時間不要超過1分鐘，否則其餘細胞容易復溫死亡，凍存管子的液氮會氣化爆炸）從液氮罐中取出凍存管並放置於裝有液氮的保溫杯中(必須用用潔淨鑷子取出凍存管，以免凍傷手)，立即把存儲架回液氮罐；用鑷子把剛才置於保溫杯的凍存管取出，並立即（不要耽擱）放入上述準備好的水浴中（放入之前快速檢查蓋子是否擰緊，蓋子切勿沒入水中，以免進水汙染），用鑷子鑷好凍存管，快速沿著容器內壁轉圈，細胞未凍融時（1min內）切勿取出觀察，細胞凍融時間一般為1-2 min，如果超過2 min仍未凍融，應棄用該管細胞，凍融後立即用70%酒精消毒該凍存管，然後立即放入超淨工作檯中；
3) 打開凍存管蓋，用移液管吹打細胞3次，然後立即把細胞轉移至提前準備的裝有5-10ml預熱的完全培養基的15ml或50離心管中；
4) 離心（？RPM，？min，室溫），小心移除上清；
5) 加入5ml預熱完全培養基，吹打重懸細胞，然後把細胞懸液轉移至T25培養瓶中，並放入二氧化碳培養箱（5% CO2, 37℃）中培養；
6) 第二天觀察細胞的貼壁情況，並進行換液；
注意事項：
1. 細胞復甦操作要求快速，否則細胞容易在凍融過程中產生冰晶，從而導致細胞死亡，所以必須提前準備好所需的培養基、培養耗材和其他所需物品，絕對不允許臨時準備；
2. 在解凍細胞前，必須把超淨工作檯準備至工作狀態，提前準備裝有5-10ml預熱的完全培養基的15ml或50離心管；
3. 為了降低復溫對其它細胞的影響，可把該存儲架子放置於裝有液氮的泡沫盒中；
4. 存儲架離開液氮罐的時間一般不要超過1分鐘，否則其餘細胞容易復溫死亡，凍存管子的液氮氣化爆炸；
5. 放入之前快速檢查蓋子是否擰緊，蓋子切勿沒入水中，以免進水汙染；
6. 細胞未凍融時（1min內）切勿取出觀察；
7. 根據復甦細胞的大小選擇合適的離心速度和時間，一般不超過1000RPM, 10min；
8. 復甦後的第二天必須要進行換液（加入培養基的量根據細胞的密度和生長速度），以降低凍存保護劑DMSO的影響；
9. 離心速度和時間依據具體細胞決定；
10. 上述是以T25培養瓶為例，具體選用何種培養器皿取決於細胞生長密度需求（啟動正常生長所需的密度）；
二、細胞換液培養
1. 全量換液：把所有的舊培養液移除，加入新的培養液（加入培養基的量根據細胞的密度和生長速度）；
2. 半量換液：把舊培養液移至15或50ml離心管中，然後在培養器皿中加入適量新培養基（避免細胞離開培養液太久），把裝有舊培養液的離心管進行離心（1000RPM, 10min），離心後，取適量舊培養上清至培養器皿中；
注意事項：
1. 全量換液適合於生長較快的腫瘤細胞，因為這些細胞可在短期內分泌足夠的因子來支撐其生長；
2. 半量換液主要適合於生長較慢的原代細胞和幹細胞，這些細胞很難在短期內分泌足夠的因子來支撐其生長，舊培養液中恰好含有這些因子；
3. 新舊培養液的配比取決於細胞的密度和生長速度及其自身的特性，請參照具體細胞的培養建議，一般為3:1（新：舊）；
4. 如果細胞發生發生汙染，切勿進行半量換液；
三、細胞傳代培養
1、當細胞密度達到其生長密度極限時（一般腫瘤細胞為80-100%，原代細胞和幹細胞為80-90%，有些細胞為40-50%，熟知所養細胞的生長密度極限），移除舊培養液；
2、用PBS洗滌兩次（舊培養中的鈣離子會抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培養瓶為例），立即蓋好蓋子，把培養瓶置於倒置顯微鏡下觀察，如大部分細胞變圓，立即移除胰酶消化液（如大部分細胞飄起，可不移除胰酶消化液），加入5ml 預熱完全培養基，用吸管取培養液吹打瓶壁細胞，使其脫離瓶壁形成單細胞懸液，離心（？RPM，？min，室溫），小心移除上清；
3、加入5ml預熱完全培養基，吹打重懸細胞用細胞計數板在顯微鏡下計算細胞數，取？細胞分裝入T25培養瓶中，添加基至總體積為5ml，置於37 ℃、5 %CO2 培養箱中培養；每隔？天傳代1次；
注意事項：
1、熟知所養細胞的生長密度極限；
2、第一次進行所養細胞傳代時，消化時必須把培養瓶置於倒置顯微鏡下觀察，並記錄所需時間，下次按照該時間執行即可；
3、進行細胞傳代時必須結合考慮細胞生長密度需求（啟動正常生長所需的密度）和實際的工作需求，在滿足細胞生長密度需求的前提下，需要多少瓶就傳多少瓶，降低工作強度和試劑耗材消耗；
4、離心速度和時間依據具體細胞決定；
四、細胞凍存保種
1、提前配製凍存液：用血清或完全培養基配製5-10%DMSO（根據具體細胞決定）凍存液；
2、消化收取細胞：當細胞密度即將達到其生長密度極限時進行換液，第二天，移除舊培養液，用PBS洗滌兩次（舊培養中的鈣離子會抑制胰酶的活性），加入1ml胰酶消化液（以T25培養瓶為例），立即蓋好蓋子，把培養瓶置於倒置顯微鏡下觀察，如大部分細胞變圓，立即移除胰酶消化液（如大部分細胞飄起，可不移除胰酶消化液），加入5ml 預熱完全培養基，用吸管取培養液吹打瓶壁細胞，使其脫離瓶壁形成單細胞懸液，離心（？RPM，？min，室溫），小心移除上清；
3、加入適量（消化前預估細胞的數量，1-2*106/ml凍存液）凍存液並吹打混勻，分裝至凍存管中，標記凍存細胞的名稱、冷凍日期、操作者姓名拼音簡寫，然後放入梯度降溫盒（提前復溫至室溫），置於-80℃過夜，次晨置於液氮罐中保存；
注意事項：
1、密切觀察細胞的生長密度，當細胞密度即將達到其生長密度極限時進行換液，以便第二天進行保種；
2、消化前進行凍存液配製，切勿用培養基和血清重懸細胞後再加入DMSO，這樣會導致局部高濃度的DMSO對細胞產生損傷；
3、消化前預估細胞的數量，加入適量凍存液，以使細胞密度為1-2*106/ml，密度過高會導致凍存保護液不足，密度過低會導致凍存液對細胞有毒性；
4、梯度降溫盒必須提前復溫至室溫，切勿從-80℃取出即可使用，這樣會導致細胞全部死亡；
5、離心速度和時間依據具體細胞決定；
細胞培養基礎問答
1. BHK細胞就是指BHK21嗎？
答：BHK細胞是指幼年敘利亞地鼠腎細胞（BabyHamster Syrian Kidney），1961年建株。原始的細胞株是成纖維細胞，貼壁依賴性。1963年獲得單細胞克隆細胞。後經無數次傳代後細胞可懸浮生長，它廣泛用於增殖各種病毒，生產獸用疫苗。
最常用的是BHK21的一個亞克隆細胞，即克隆13或C13 。
2. 二倍體細胞有什麼特點？
答：二倍體細胞的染色體組型是2n核型；貼壁依賴接觸抑制；一般可傳代培養50代；無致瘤性。如W1-38：正常胚肺組織人二倍體細胞系。MRC-5：從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細胞系。
3. 什麼是動物細胞大規模培養？
答：所謂動物細胞大規模培養技術（large-scaleculture technology）是指在人工條件下（設定pH、溫度、溶氧等），在細胞生物反應器（bioreactor）中高密度大量培養動物細胞用於生產生物製品的技術。目前可大規模培養的動物細胞有雞胚、豬腎、猴腎、地鼠腎等多種原代細胞及人二倍體細胞、CHO（中華倉鼠卵巢）細胞、BHK-21、Vero細胞(非洲綠猴腎傳代細胞)等，並已成功生產了包括狂犬病疫苗、口蹄疫疫苗、A型肝炎疫苗、B型肝炎疫苗、紅細胞生成素、單克隆抗體等產品。
在過去幾十年來，細胞培養技術經有了很大發展，從使用轉瓶(rollerbottle) 、CellCube等貼壁細胞培養，發展為生物反應器（Bioreactor）進行大規模細胞培養。
4. 細胞體內外培養的差別是什麼？
答：細胞離體後，失去了神經體液的調節和細胞間的相互影響，生活在缺乏動態平衡相對穩定環境中，日久天長，易發生如下變化：分化現象減弱；形態功能趨於單一化或生存一定時間後衰退死亡；或發生轉化獲得不死性，變成可無限生長的連續細胞系或惡性細胞系。因此，培養中的細胞可視為一種在特定的條件下的細胞群體，它們既保持著與體內細胞相同的基本結構和功能，也有一些不同於體內細胞的性狀。實際上從細胞一旦被置於體外培養後，這種差異就開始發生了。
5. 什麼是無血清培養基？與普通培養基有什麼區別？
答：無血清培養基(serumfree medium,SFM):是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養基。但是它們可能包含個別蛋白或大量蛋白組分。基本成分為基礎培養基及添加組分兩大部分。添加組分可能包括纖連蛋白、層粘連蛋白等貼壁因子、胰島素、轉鐵蛋白、硒等。
6. 什麼是無血清無動物組分培養基、無蛋白培養基和限定化學成分培養基？
答：無血清無動物組分培養基是不含任何動物來源成份的無血清培養基，但可能添加植物蛋白或重組蛋白。
無蛋白培養基（proteinfree midium,PFM）:即不含有蛋白的培養基，無論是植物蛋白或動物蛋白。
成分培養基(chemicaldefined medium,CDM):是指培養基中的素有成分都是明確的，它同樣不含有蛋白，也不是添加了植物水解物，而是使用了一些已知結構與功能的小分子化合物，如短肽等。這種培養基更有利於分析細胞的分泌產物和產品純化。
7. HEPES在細胞培養過程中起什麼作用？
答：HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了5%CO2的環境，CO2氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPES。
8. CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
答：定期(至少每兩周一次)以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。
培養基生產和使用常見問題
1. 低血清培養基能用肉眼判斷其pH值嗎？
答：低血清培養基中酚紅的含量與普通培養基中的酚紅含量不同，不能通過肉眼觀察或通過經驗來判定pH值，建議使用pH計進行測定。
2. 低血清培養基的緩衝系統是什麼？
答：平衡鹽一般是由無機鹽及葡萄糖組成的。平衡鹽有Hanks′系統、Earle′s系統、Dulbecco′s磷酸緩衝鹽系統等。199系列培養基、MEM系列培養基均有Hanks′系統的培養基及Earle′s系統的培養基。但是有些培養基均不是以上常規的平衡鹽系統，例如RPMI1640培養基、F12培養基。MEM(SLM)低血清培養基的平衡鹽系統也不是常規的平衡鹽系統，該平衡鹽系統的緩衝能力強於常規平衡鹽系統的緩衝能力。
3. 穀氨醯胺溶液和碳酸氫鈉的配製方法是什麼？
答：以0.2mol/L的 L-穀氨醯胺配製為例：稱取L-穀氨醯胺2.92g，加注射用水100ml，充分攪拌混勻。用0.2μm濾膜正壓過濾除菌。溶液應在4℃下避光保存，2周內使用。
以7.5%NaHCO3的配製為例：稱取NaHCO37.5g溶於100ml蒸餾水中過濾除菌。
4. 什麼培養基中可以省去加酚紅？
答：酚紅在培養基中用作pH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，鹼性時為紫色。酚紅本身對生物製品質量並不會產生影響，可以通過純化技術去除，但酚紅在無血清培養基可能帶來胞內鈉/鉀失衡，影響細胞生長，當然這種作用能被血清所中和或減輕。酚紅並不是培養基中必需的一種成分，很多國外的疫苗或抗體生產企業在生產過程中都使用無酚紅培養基。
5. 放置在冰箱中的培養基顏色會發生變化，為什麼？
答：培養基保存於4℃冰箱中，培養基內CO2會逐漸溢出，造成培養基越來越偏鹼性。而培養基中酸鹼指示劑（通常為phenolred）的顏色也會隨鹼性增加而更偏暗紅。培養基偏鹼後再用於細胞培養將造成細胞生長停滯或死亡。培養基偏鹼時，可以通入無菌過濾的CO2，以調整pH值。
6. 無血清培養與有血清培養使用的抗生素量一樣嗎？
答：當在無血清培養基中添加抗生素時，降低至少在有血清培養基中所使用濃度的50%。因為血清中的蛋白會結合和滅活一些抗生素。而在無血清培養條件下，抗生素不被滅活。
7. 培養基中添加了血清和抗生素後，可長期保存嗎？
答：一旦您在新鮮培養基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩到三周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍後就開始降解。
8. 什麼是個性化培養基？它有什麼優點？
答：根據細胞類型、培養方式和生產工藝等特點所定製的培養基，即個性化培養基。個性化培養基在國外生物製藥企業被普遍採用，個性化培養基可以為細胞生長提供充足的營養物質，能提高細胞的生長速率、培養密度、以及延長細胞維持時間；也可以為細胞生長提供均衡的營養供給，減少細胞有害代謝物質的積累，降低對細胞生長的危害；同時對貼壁細胞而言，能增加細胞的貼壁性，並降低培養過程中剪切力對細胞的損傷；個性化培養基可以根據各戶的特殊需求減少或不使用動物源成分，從而使生物製品安全性更有保障。
9. 細胞培養基偶然被凍，可否繼續使用？
答：如果細胞培養基偶然被凍，您應該自然溶解培養基並觀察是否有沉澱產生。如果沒有沉澱產生，培養基可以正常使用，如果出現沉澱，只能丟棄這些培養基。
10. 細胞冷凍培養基之成份為何？
答：動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5- 10%DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95%原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意：由於DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配製完成。
11. 培養基及其它添加物和試劑可反覆凍融嗎？
答：大部分添加物和試劑最多可以凍融3次，如果次數過多會將使含有的蛋發生降解和沉澱，這將會影響它的性能。
12. 液體培養基的保存是冷藏好？還是冷凍好？
答：要冷藏！！通常液體培養基在冷藏條件下可存放6個月到一年。
常見血清使用問題
1. 血清使用時一定需要滅活麼？
答：實驗顯示，經過正確處理的熱滅活血清對大多數的細胞而言是不需要的。經此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或完全沒有任何作用，甚至因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經過熱處理的血清，沉澱物的形成會顯著的增多，這些沉澱物在倒置顯微鏡下觀察，像是「小黑點」，常常會讓研究者誤以為是血清遭受汙染，而把血清放在37℃環境中，又會使此沉澱物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節省時間，更確保血清的質量。
2. 何謂FBS, FCS,CS, HS?
答：FBS(fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清，FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS(calf serum) 則是指小牛血清。HS(horseserum) 則是指馬血清。
3. 保存血清最好的方法是什麼?
答：我們建議血清應保存在-5℃至-2O℃。若存放於4℃時，請勿超過一個月。若一次無法用完一瓶，建議無菌分裝血清至恰當的滅菌容器內，再放回冷凍。
4. 如何解凍血清才不會使產品質量受損?
答：將血清從冷凍箱取出後，先置於2～8℃冰箱使之融解，然後在室溫下使之全融。但必須注意的是，融解過程中必須規則地搖晃均勻。
5. 血清解凍後發現有絮狀沉澱物出現，該如何處理?
答：血清中沉澱物的出現有許多種原因，但最普遍的原因是由於血清中脂蛋白的變性所造成，而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍後，也會存在於血清中，亦是造成沉澱物的原因之一。但這些絮狀沉澱物，並不影響血清本身的質量。若欲去除這些絮狀沉澱物，可以將血清分裝至無菌離心管內，以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉澱物，因為它可能會阻塞過濾膜。
6. 如何避免血清中沉澱物的產生?
答:(1)解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產生沉澱物。
(2)解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉澱的發生。
(3)請勿將血清置於37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。
(4)血清的熱滅活非常容易造成沉澱物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。
(5)若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，並且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉澱物的增多。
細胞培養常用試劑使用問答
1. 穀氨醯胺使用方法是什麼？
答：穀氨醯胺在溶液中很不穩定，故4℃下放置1周可分解50%，使用中最好單獨配製，置-20℃冰箱中保存，用前加入培養液中。
2. 碳酸氫鈉在室溫條件存放是否穩定？
答：碳酸氫鈉白色粉末，或不透明單斜晶系細微結晶。比重2.159。無臭、味鹹，可溶於水，微溶於乙醇。其水溶液因水解而呈微鹼性，受熱易分解，在65℃以上迅速分解，在270℃時完全失去二氧化碳，在乾燥空氣中無變化，在潮溼空氣中緩慢分解。
3. 培養細胞生長減慢的原因有哪些？其解決辦法有哪些？
答：可能得原因有：更換了不同的培養液或血清；培養液中一些細胞生長必需成分如穀氨醯胺或生長因子等耗盡或缺乏或已被破壞；培養物中有少量細菌或真菌汙染；試劑保存不當；比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗找出可能的原因。
解決辦法：增加起始培養細胞濃度；讓細胞逐漸適應新培養液；換入新鮮配製培養液；補加穀氨醯胺或生長因子等；用無抗生素培養液培養，如發現汙染，丟棄培養物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培養液需在2－8℃避光保存；含血清完全培養液在2-8℃保存，並在2 周內用完；分離培養物，檢測支原體。
4. L-穀氨醯胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？
答：L-穀氨醯胺在細胞培養時非常重要的。脫掉氨基後，L-穀氨醯胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-穀氨醯胺在溶液中經過一段時間後會降解，降解率隨保存溫度而變。L-穀氨醯胺的降解導致氨的形成，而氨對於一些細胞具有毒性。
5. 細胞傳代消化時所用胰酶濃度越高越好嗎？
答：不見得！因為胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++,Mg++離子和血清等因素有關。通常情況下，pH8.0 , 溫度37 oC 其作用能力最強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。我們每次進行傳代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反覆衝洗細胞培養瓶，以便於將含血清的培養基衝洗乾淨，這樣就能大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：
（1）0.05％胰蛋白酶＋0.02％EDTA；
（2）0.25% 胰蛋白酶
多數細胞傳代消化可使用0.25％胰蛋白酶＋0.02％EDTA這種消化液。
6. 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什麼？
答：二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。
7. GlutaMAX-I是什麼？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？
答：GlutaMAX-I即谷丙氨酸二肽，是一個L-穀氨醯胺的衍生物，其不穩定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-穀氨醯胺供利用。GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-穀氨醯胺幾乎完全降解。
8. 培養基中丙酮酸鈉的作用是什麼？
答：丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源，儘管細胞更傾向於以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。
9. Hank′s 平衡鹽溶液(HBS)和Earle′s平衡鹽溶液(EBS)有什麼本質的功能差別？
答：HBS和 EBS 的主要差別在於碳酸氫鈉的水平,在Eagle′s (2.2g/L)中比在Hanks′ (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡，以維持溶液的PH值。Eagle′s液在空氣水平的CO2中，溶液會變鹼，Hanks′液在CO2培養箱中會變酸。如果希望在CO2培養箱中保存組織，需要用Eagle′s液，。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks′液就可以了。
細胞培養過程常見問題
1. 為什麼培養的細胞要及時傳代？
答：體外培養的細胞大多具有生長接觸抑制的特性，也就是說當一個細胞被其他細胞包圍的時候，它就會停止生長，及時傳代後，細胞的生長得以繼續。
2. 培養液pH下降很快可能原因有哪些？其解決辦法是什麼？
答：通常細胞生長得非常快時，pH值通常下降得很快。此時可以及時傳代、提高傳代比例或降低血清量等方法進行解決。此外，培養瓶蓋擰得太緊、NaHCO3緩衝系統緩衝能力不夠、培養液中鹽濃度不正確、細菌、酵母或真菌汙染等也能導致pH值通常下降得很快。
（1）按培養液中NaHCO3濃度增加或減少培養箱內CO2濃度，2.0g/L 到3.7g/L 濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。
（2）改用不依賴CO2培養液。
（3）鬆開瓶蓋1/4 圈。加HEPES 緩衝液至10 到25mM終濃度。
（4）在CO2 培養環境中改用基於Earle′s鹽配製的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hanks鹽配製的培養液。
（5）如果是汙染造成的則丟棄培養物或用抗生素除菌。
3. 培養液pH對細胞生長的影響？
答：由於大多數細胞適宜pH為7.2-7.4，偏離此範圍可能對細胞生長將產生有害的影響。但各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養細胞一般對pH變動耐受差，無限細胞系耐受力強。但總體來說，細胞耐酸性比耐鹼性強一些。在配製培養用液時，需要注意一點：培新配的培養基在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。
4. 購買之細胞冷凍管經解凍後，為何會發生細胞數目太少之情形？
答：研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍後不要立刻離心，應待細胞生長隔夜後再更換培養基即可。但對於DMSO敏感的細胞，還是復甦細胞時，用離心去除DMSO比較好。
5. 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
答：研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，原因比較複雜，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳；血清使用錯誤或血清的品質不佳；解凍過程錯誤；冷凍細胞解凍後，加以洗滌細胞和離心；懸浮細胞誤認為死細胞；培養溫度使用錯誤；細胞置於–80 ℃太久等。建議嚴格參照ATCC或ECACC的標準操作規程進行細胞復甦、凍存等工作。
6. 支原體汙染會對細胞培養有何影響？
答：支原體汙染幾乎可影響所有細胞之生長參數、代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。
7. 冷凍保存細胞之方法？
答：冷凍保存方法一:冷凍管置於4℃（30－60 分鐘）→-20℃(30 分鐘)→ -80℃（16－18 小時或隔夜）→液氮罐長期儲存。
冷凍保存方法二:冷凍管置於已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3℃至–80 ℃以下，再放入液氮中長期儲存。注意：-20℃不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
8. 懸浮細胞應如何繼代處理？
答：一般僅需持續加入新鮮培養基於原培養瓶中，稀釋細胞濃度即可。若培養液太多時可分瓶取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養瓶中，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重複前述步驟即可。
9. 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
答：欲回收動物細胞，其離心速率一般為300×g(約1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉速過長時間都將造成細胞死亡。合適的離心轉速是根據相對離心決定。
RCF=1.119×105×r×(rpm)2
r為離心機轉軸中心與離心套管底部內壁的距離；rpm為離心機每分鐘的轉數；RCF(relativeeentrifugal force)為相對離心力，以重力加速度g（980.66cm/s2）的倍數來表示表示單位。
10. 培養細胞時應使用5%還是10%CO2，或者根本沒有影響？
答：一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩衝系統，而培養基中NaHCO3的含量將決定細胞培養時應使用的CO2濃度。當培養基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細胞培養時應使用10%CO2；當培養基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應使用5%CO2培養細胞。
11. 細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？
答：除少數特別註明對DMSO敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之後，應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養方瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍後細胞無法生長或貼附之問題。
12. 冷凍管應如何解凍？
答：取出冷凍管後，須立即放入37℃水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1－2 分鐘內大部分融化，特別注意，需殘留一小塊冰塊，就可拿到超淨工作檯操作細胞，用75％消毒凍存管，用新鮮培養基將細胞轉移至培養瓶。另外冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。
13. 如何用臺盼蘭計數活細胞？
答：將樣品適當稀釋後，用稀釋後的樣品和0.4％的臺盼蘭溶液按1:1混合後，用移液槍點樣到血球計數板，置於倒置顯微鏡下觀察、計數，其中藍色細胞是死細胞，因活細胞排斥臺盼蘭，不被染色。
14. 細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
答：冷凍管內細胞數目一般為1-8×106cells/ml vial。
15. 細胞冷凍培養基之成份為何？
答：動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含9- 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由於DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細胞液中，必須使用前先行配製完成。
16. 如何消除組織培養的汙染？
答：當重要的培養細胞汙染時，研究者可能試圖消除或控制汙染。首先，確定汙染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把汙染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超淨臺，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗黴菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗黴菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性黴素B和抗黴菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養汙染的實驗步驟。
1）在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2）分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度範圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性黴素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0mg/ml。
3）每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4）確定抗生素毒性水平後，使用低於毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2－3代。
5）在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6）重複步驟4。
7）在無抗生素的培養基中培養4－6代，確定汙染是否以已被消除。
17. 培養細胞出現死亡其可能的原因有什麼？解決辦法有哪些？
答：可能的原因有培養箱內無CO2；培養箱內溫度波動太大；細胞凍存或復甦過程中損傷；培養液滲透壓不正確；培養液種有毒代謝產物堆積等。
解決辦法可以檢測培養箱內CO2濃度，檢查培養箱內溫度；取新的保存細胞種；檢測培養液滲透壓等；換入新鮮培養液等。
18. 國內可以買到細胞株的地方有哪些？
答：可以從國內多家代理廠家買到ATCC或ECACC的細胞株，同時國內可以買到細胞株的地方還有中國醫學科學院（協和醫科大學）基礎醫學部，中國科學院細胞研究所以及武漢大學冷藏中心等。
19. 細胞的滲透壓耐受性是多少？
答：細胞必須生活在等滲環境中，大多數培養細胞對滲透壓有一定耐受性。人血漿滲透壓290mOsm/kg,可視為培養人體細胞的理想滲透壓。鼠細胞滲透壓在320mOsm/kg左右。對於大多數哺乳動物細胞，滲透壓在260－320mOsm/kg的範圍都適宜。
20. 支原體(mycoplasma)汙染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
答：不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體汙染的細胞株，無法以其外觀分辨之。
21. 怎樣查到一個特定細胞株的相關知識和培養條件？
答：ATCC(American Type Culture Collection) 收集了絕大多數細胞的詳細資料。打開ATCC網頁的Cells andhybridomas連結，輸入細胞名稱就可以搜索ATCC的細胞資料庫。資料庫中有每一種細胞的詳細描述，包括細胞的來源，培養和凍存條件，以及相關文獻等資料。
22. 為什麼要在溶解的一周內使用貯存在4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液?答：胰蛋白酶在4℃就可能開始降解，如果在室溫下放置超過30分鐘，就會變得不穩定。
11、人DC細胞培養和收穫問題。
問：(1)當DC養到5-6天的時候是不成熟DC，它是貼壁生長的，如果我要用這種DC，如何把它製成懸液呢？製成懸液後它的功能形態會改變嗎？(2)6天後加入刺激它成熟的因子後，它就是成熟DC並且懸浮起來了嗎？或者如果DC貼壁的時候我可以用一些蛋白來評價它捕獲抗原的能力嗎？
答：(1)可以將人的單核細胞加入IL-4和GM－CSF向DC誘導，觀察到隨著培養時間的延長，細胞形態由圓形逐漸轉變為多突起形，也逐漸浮起來，並不是完全貼壁生長的。吸起來製成懸液之後計數觀察，形態沒有變化。進行流式細胞術檢測，CD14下調，CD1a、CD80、CD86、HLA-DR都上調，CD83變化不大。
(2)6天後加入TNF-a或者LPS，懸浮起來的細胞更多，進行流式細胞術檢測，CD14下調，CD1a、CD80、CD86、HLA-DR都繼續上調，CD83也大幅上調。
細胞培養常見問題解答
問題
可能原因
建議解決方法
培養液pH值變化太快
CO2張力不對。
培養瓶蓋擰得太緊。
NaHCO3緩衝系統緩衝力不足。
培養液中鹽濃度不正確
細菌、酵母或真菌汙染
（1）按培養液中NaHCO3濃度增加或減少培養箱內CO2濃度，2.0g/L 到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5％到10％。
（2）改用不依賴CO2培養液。
鬆開瓶蓋1/4圈。
加HEPES緩衝液至10到25mM終濃度。
在CO2培養環境中改用基於Earle′s 鹽配製的培養液，在大氣培養環境中培養改用Hanks鹽配製的培養液。
丟棄培養物。
或用抗生素除菌。
培養液出現沉澱，但pH值不變
用洗滌劑清洗後殘留磷酸鹽將培養基成分沉澱下來
冰凍保存培養液
用去離子水反覆衝洗玻璃器皿，然後除菌。
將培養液加熱到37℃，搖動使其溶解如沉澱仍然存在，丟棄培養液。
培養液出現沉澱，同時pH發生變化
細菌或真菌汙染
丟棄培養物。
或用抗生素除菌。
培養細胞不貼壁
胰蛋白酶消化過度
支原體汙染
培養液中無貼壁因子
縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度。
分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體汙染，丟棄培養物。
懸浮細胞成簇
培養液中含鈣、鎂離子
支原體汙染
蛋白酶過度消化使得細胞裂解釋放DNA
用無鈣鎂平衡鹽溶液洗滌細胞，輕輕吹吸細胞獲得單細胞懸液。
分離培養物，檢測支原體。如發現支原體汙染，丟棄培養物。
用DNase I處理細胞。
原代細胞培養物汙染
原代培養組織在進入培養前已汙染
培養前用含高濃度抗生素的平衡鹽溶液反覆衝洗組織。
培養細胞生長減慢
由於更換不同培養液或血清
培養液中一些細胞生長必需成分如穀氨醯胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞。
培養物中有少量細菌或真菌汙染
試劑保存不當
接種細胞起始濃度太低
細胞已老化
支原體汙染
比較新培養液與原培養液成分，比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗。
增加起始培養細胞濃度。
讓細胞逐漸適應新培養液。
換入新鮮配製培養液。
補加穀氨醯胺或生長因子。
用無抗生素培養液培養，如發現汙染，丟棄培養物。或用抗生素除菌。
血清需保存在-5℃到-20℃。培養液需在2－8℃避光保存。含血清完全培養液在2-8℃保存，並在2周內用完。
增加接種細胞起始濃度。
換用新的保種細胞。
分離培養物，檢測支原體。清潔支架和培養箱。如發現支原體汙染，丟棄培養物。
培養細胞死亡
培養箱內無CO2
培養箱內溫度波動太大
細胞凍存或復甦過程中損傷
培養液滲透壓不正確
培養液中有毒代謝產物堆積
檢測培養箱內CO2
檢查培養箱內溫度
取新的保存細胞種
檢測培養液滲透壓。注意：大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260 – 350 mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養液滲透壓。
換入新鮮培養液