為了更好地記載科學歷史、傳承科學精神、引領科學風尚，《中國科學：生命科學》中文版根據自身綜合性期刊的定位和特色，在新中國成立70周年之際，組織出版「新中國成立70周年生命科學研究進展專輯」。「專輯」將回顧總結新中國成立70年，特別是改革開放40周年以來，我國在生命科學各領域所取得的重要進展和突出成就，展望未來發展趨勢。
近日，「專輯」文章之一，由植物免疫研究領域周儉民研究員、王源超教授等多位知名學者聯合撰寫的「植物免疫研究與抗病蟲綠色防控：進展、機遇與挑戰」在線出版。該文從植物免疫受體及信號轉導研究、病原基因組研究、病原效應蛋白研究、植物與病毒互作機制研究、免疫與生長平衡、抗病蟲基因的分離鑑定和抗病蟲育種、植物病蟲害防控與生物技術7個方面對我國植物免疫領域工作進展進行了系統性的總結和梳理，並對我國植物免疫領域研究面臨的機遇與挑戰進行了分析討論。
植物病蟲害造成農作物減產、品質下降, 是世界各國農業生產中的主要威脅. 為控制農業病蟲害, 我國每年農藥防治面積達5.6112億公頃次, 為全國耕地面積的4.16倍, 即平均每年每一塊耕地上至少實施防治４次以上, 對生態環境和人民健康造成巨大壓力. 培育抗病蟲品種是農作物抗病蟲綠色防控的重要手段, 而植物免疫學是抗病蟲育種的理論基礎.
1905年, 英國小麥遺傳學家Biffen首次在小麥中發現抗病基因; 20世紀30年代美國學者Stakman提出生理小種概念; 20世紀40年代美國學者Flor提出基因對基因假說, 為植物免疫學發展奠定了遺傳基礎. 西方學者在20世紀早期曾提出的「植物免疫」的概念, 被我國李振岐和吳友三先生採用. 但早期的植物免疫概念僅僅是對植物抗病(免於疫病)現象的描述, 並未與動物的免疫系統進行比較與關聯. 隨著植物抗病基因的克隆, 人們發現, 植物抗病基因編碼的免疫受體與20世紀90年代在果蠅和哺乳動物中發現的先天免疫(也稱天然免疫或固有免疫, innate immunity; natural/native immunity)受體類似, 由此認識到植物雖然不具有脊椎動物中的獲得性免疫(adaptive immunity), 但具有同動物相似的先天免疫機制.
植物免疫理論的主要框架形成於2006年, 其要點是植物利用位於細胞表面和胞內的兩大類免疫受體, 識別病毒、細菌、真菌、卵菌、線蟲、昆蟲等入侵生物, 激活植物免疫系統從而保護自己; 而病原生物感染寄主植物時, 會向寄主細胞間或細胞內分泌效應蛋白(effectors), 幹擾寄主的正常生理活動, 以利於其侵染或定殖. 細胞表面免疫受體也被稱為模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs), 主要由單次跨膜的類受體激酶(receptor-like kinases, RLKs)和類受體蛋白(receptor-like proteins, RLPs)組成, 在細胞表面識別來自入侵生物的分子模式和植物自身來源的、與感染損傷相關的分子模式(molecular patterns, 下文中統稱激發子), 其激活的免疫被稱作模式觸發的免疫(pattern-triggered immunity, PTI). 胞內免疫受體主要為一類包含核苷酸結合結構域和亮氨酸富集重複區的受體類蛋白(nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat receptors, NLRs), 識別進入到植物細胞內的入侵生物效應蛋白, 其激活的免疫被稱作效應蛋白觸發的免疫(effector-triggered immunity, ETI). 近期研究表明, 動植物免疫受體識別入侵生物的分子機制高度類似, 主要通過「直接結合模式」「警戒模式」「誘餌模式」等方式對入侵生物進行識別, 進而特異性地啟動下遊免疫途徑. 除了基於免疫受體的識別系統外, 植物還具有由小RNA介導的基因沉默系統, 進而識別與防禦病毒等病原生物的入侵.
自20世紀末以來, 我國科學家在植物抗病蟲理論研究及病蟲害綠色防控生物技術發展中取得了長足進步. 在過去20年間, 中國學者在植物免疫研究領域發表論文量排名和ESI(Essential Science Indicators)高水平論文量排名均位居世界第二(圖1). 從年度趨勢看, 我國在植物免疫學領域發表論文量增長迅速, 由1999年的24篇增長到2018年的967篇, 並在2015年以後論文量躍居第一(圖2). 以我國學者為通訊作者或共同通訊作者在三大頂級期刊發表的植物免疫領域的研究論文, 前10年僅有1篇, 但到第二個10年已經多達12篇, 呈現爆發式增長的態勢.
植物免疫領域主要國家論文量佔比.A: 中國發表論文量佔比排名世界第二; B: 中國發表ESI高水平論文量佔比排名世界第二
1999~2018年植物免疫領域國際、美國、中國論文量
我國學者在植物免疫研究的多個方向做出了突出貢獻, 多人應邀在國際主流期刊撰寫相關方向綜述文章, 包括植物免疫受體作用機制、免疫信號轉導、病原效應蛋白和致病機制研究、植物病毒致病機制、免疫與生長平衡機制、抗病蟲基因的分離鑑定、RNAi(RNA interference)介導的植物抗病毒免疫以及利用小RNA幹擾和基因編輯技術創製抗病蟲新種質、病原基因組學和流行規律研究等. 我國學者已經成為在國際上推動植物免疫學發展的重要生力軍.
1 植物免疫受體及信號轉導研究
免疫的實質是高等生物通過識別「非我」或「異己」(non-self), 發起對入侵生物的攻擊指令, 從而保護自我. 因此, 免疫受體及其信號轉導途徑的研究是植物免疫學的核心所在. 我國在不同類型免疫受體的發現以及作用機制解析方面取得了令人矚目的成就.
1.1 NLR類型受體的作用機制研究取得一系列重要進展
抗病基因編碼的蛋白中, NLR蛋白約佔70%. 每個植物物種中NLR基因的數目常常高達數百個, 並且種間和種內均呈現高度多樣性, 組成一個龐大的NLR組(NLRome), 但也有一些植物如木瓜和黃瓜的NLR基因只有幾十個, 說明不同植物的NLR基因組組成存在獨立進化. 因此, 植物NLR基因組分析對理解抗病基因進化、NLR蛋白的類型以及發現新的NLR基因及功能具有重要意義. 南京大學研究組系統研究了植物NLR基因的起源, 構建了陸地植物NLR基因譜系圖, 為後人發現不同NLR蛋白間的互作規律提供了重要的路徑.
我國多個研究組發現, 植物NLR受體有時以成對的方式在染色體上排列並執行功能. 比如, 中國科學院植物生理生態研究所的團隊發現, 稻瘟病廣譜抗性遺傳位點Pigm編碼兩個功能拮抗的NLR蛋白PigmR和PigmS, 共同控制對稻瘟病的抗性和產量性狀的平衡. 其中, PigmR通過形成同源二聚體發揮抗性作用; 而PigmS與PigmR競爭形成異源二聚體, 抑制PigmR介導的抗病性. 這一發現突破了前人對成對NLR蛋白作用模式的認知: 即兩個互作的NLR蛋白之間的關係並不一定是互補, 也可以是拮抗.
NLR受體對病原效應蛋白的識別機制和活性控制機制一直是植物免疫研究的重要課題. 北京生命科學研究所團隊發現了NLR蛋白SUMM2通過監控MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4級聯通路, 識別細菌效應蛋白HopAI1的機制. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所與清華大學的合作團隊發現, NLR免疫受體RPM1的活性受到其互作蛋白RIN4中的一個脯氨酸殘基的順反構象調控, 而該殘基構象受到肽基脯氨醯異構酶ROC1的調控, 從而揭示了一種新的NLR活性控制模型. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究組與法國學者合作發現, 擬南芥NLR蛋白ZAR1特異識別野油菜黃單胞菌效應蛋白AvrAC. ZAR1對AvrAC的識別, 還需要另外兩個蛋白RKS1和PBL2一起完成. 其中, RKS1與ZAR1形成靜息狀態的受體複合物, 而PBL2作為一個誘餌蛋白, 受到AvrAC修飾後被招募到ZAR1-RKS1複合物並激活ZAR1介導的抗病性. 南京農業大學團隊與美國學者合作發現, 番茄斑萎病毒移動蛋白NSm中的保守肽段NSm21被番茄NLR免疫受體蛋白Sw-5b識別激活廣譜抗性; 並闡明了Sw-5b一個特殊的N端結構域在NLR蛋白活性控制中的新機制. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所的團隊首次發現, 只具備TIR-NBS結構域的TN2蛋白能通過鈣依賴激酶CPK5發揮抗病功能, 並提供了胞吐系統受到NLR監控的證據. 清華大學的研究組發現, 菸草蛋白NbMIP1是NLR蛋白Tm-22監控病毒蛋白MP所必需的組分. 中國農業大學的團隊與法國學者合作發現, 水稻中一個NLR的嵌入式誘餌結構域HMA(heavy metal-associated)能識別兩個不同的稻瘟菌效應蛋白.
我國學者還發現了多個NLR蛋白通過轉錄因子直接調控免疫的新證據. 北京生命科學研究所的團隊發現, NLR蛋白SNC1通過與轉錄抑制因子TPR1互作, 控制免疫相關基因的表達和抗病性. 武漢大學的團隊發現, NLR蛋白Bph14通過與轉錄因子WRKY46/72互作, 激活對昆蟲的免疫反應.
我國學者在NLR編碼基因的表觀調控、RNA剪切、蛋白穩定性調控以及亞細胞定位等多個方面也取得了進展. 香港浸會大學的研究組發現, NUDT6是NLR蛋白SNC1新的負調控因子. 中國科學院植物生理和生態研究所團隊通過對PigmS啟動子研究發現,PigmS基因的表達受到甲基化調控, 在花粉中特異高表達, 而在葉片、莖稈等病原菌侵染的組織部位表達量很低. 由於PigmS低水平表達, 可能降低了稻瘟病菌的選擇壓力, 致使PigmR對稻瘟病菌一直具有廣譜抗性. 因此, 該項工作揭示了通過表觀遺傳控制PigmS表達, 實現對PigmR的低水平拮抗, 從而平衡抗病和產量的機制, 這也為培育高抗高產協調的作物品種提供了一個新的思路. 該團隊最近發現,PigmR與其他結構類似的廣譜抗病NLR可直接與具有RRM(RNA recognition motif)結構域的PIBP1等蛋白互作, 對PigmR介導的抗性發揮作用, 並由此發現了一個全新的RRM植物轉錄因子家族, 可直接控制防衛相關基因的表達, 拓展了植物轉錄因子家族.
1.2 NLR蛋白結構研究取得重大突破
自從20世紀90年代首次被鑑定到以來, 植物NLR蛋白作用機制研究進展緩慢. 其中的一個重要原因是缺乏完整NLR蛋白的結構. 清華大學的團隊早期解析了細菌效應蛋白AvrPto與番茄誘餌蛋白Pto複合物以及大麥NLR蛋白MLA的CC(coiled-coil)結構域的結構, 發現了誘餌蛋白激活NLR的潛在機制和CC結構域的信號功能. 最近, 來自中國科學院遺傳與發育生物學研究所與清華大學的聯合團隊, 首次發現了植物抗病小體(resistosome)的存在並揭示了NLR蛋白激活免疫的全新機制. 該團隊通過對擬南芥NLR受體ZAR1蛋白多個複合物的結構和功能解析, 闡明了ZAR1在識別病原效應蛋白後, 如何從靜息狀態, 經過中間狀態, 最終形成活性的五聚體抗病小體的分子過程; 揭示了抗病小體在細胞質膜上激活免疫信號和細胞死亡的分子機制. 受此成果影響, NLR蛋白研究成為2019年的國際植物微生物分子互作大會的主題. 該研究成果是國際植物免疫學研究領域25年來重要的裡程碑式進展, 也是我國科學家在植物免疫研究領域取得的重大突破性成果, 對未來高效和合理利用植物NLR蛋白, 進而改良植物抗病性具有重要指導意義.
1.3 模式識別受體作用機製取得重大突破
模式識別受體通過識別來自入侵生物或者植物自身的激發子引發植物免疫反應, 其作用機制是植物免疫研究的另一個前沿方向. 我國學者發現了來自病原細菌、真菌和卵菌的多個激發子. 南京農業大學的研究組發現, 大豆疫黴菌的胞外效應蛋白XEG1具有激發子活性; 進一步的功能基因篩選發現, 菸草類受體蛋白RXEG1是其受體, 由於XEG1同源蛋白在致病卵菌和真菌中廣泛存在, RXEG1的發現有望改良作物對這些病菌的廣譜抗性. 中山大學的研究組發現了水稻中兩個含lysin motif(LysM)結構域的PRR蛋白OsLYP4和OsLYP6作為免疫受體識別細菌肽聚糖和真菌幾丁質, 激活植物免疫反應, 是在植物中首個發現的細菌與真菌雙重分子模式識別受體. 我國學者還多次發現類受體激酶在針對細菌、真菌和昆蟲病原的抗性中發揮重要作用.
北京生命科學研究所的團隊發現, 擬南芥中的類受體蛋白SNC2負調控植物免疫, 而這一過程很可能獨立於NLR蛋白, 還發現兩個類受體激酶BIR1和SOBIR1共同調控植物細胞死亡與免疫反應. BIR1通過與共受體蛋白BAK1互作發揮作用; 而SOBIR1後來被發現是一個十分重要的新型共受體, 在RLP類型的模式識別受體途徑中發揮作用. 清華大學團隊與國外華人學者合作完成了BIR1-BAK1複合物的結構解析, 發現了BIR1-BAK1互作的獨特模式, 為理解BAK1這一重要共受體的作用模式提供了重要信息. 西北農林科技大學團隊與國外研究組合作發現了免疫受體複合體的負調控因子BIR3. 臺灣大學的研究組發現了兩個類受體激酶直接與PRR受體FLS2互作, 並正向調控PTI, 暗示模式識別受體複合物比預想的複雜.
我國學者在模式識別受體的結構與功能解析方面取得了重大突破. 清華大學與中國科學院遺傳與發育生物學研究所的聯合團隊完成了重要模式識別受體FLS2和共受體CERK1與配體複合物的結構解析, 發現CERK1通過胞外LysM結構域二聚化來完成對真菌細胞壁組分長鏈幾丁質多糖的感應, 使其胞內激酶結構域磷酸化並激活下遊防衛反應信號通路. 該項工作不僅對植物免疫識別機制的理解具有重要意義, 還為解析微生物-植物共生系統中受體的工作機制提供了重要參考. 中國科學院上海植物生理與生態研究所的團隊發現, 豆科植物的CERK1在免疫和共生中均發揮重要作用. 清華大學與中國科學院合作團隊還發現, 細菌鞭毛蛋白以「分子膠」的形式直接結合模式識別受體FLS2和共受體BAK1的胞外結構域, 進而誘導FLS2與BAK1胞外域間的互作, 形成具有活性的FLS2-鞭毛蛋白-BAK複合體, 激活植物免疫系統. 該研究證實多年來關於BAK1是鞭毛蛋白的共受體這一猜測, 解決了一個懸而未決的重要科學問題. 由於鞭毛蛋白在病原細菌中廣泛存在, 該研究的發現將有助於設計廣譜抗病的農作物. 此外, 清華大學團隊還解析了模式識別受體PEPR與植物損傷相關分子模式-小肽Pep1的複合物結構, 這一研究為揭示植物受體激酶感受內源小肽激素的機制提供了重要線索. 清華大學團隊與瑞士學者合作, 解析了由受體激酶FER、共受體LLG1以及RALF小肽激素形成的複合物結構, 揭示了該受體的作用機制. 由於FER和LLG1均在植物生長發育和免疫中發揮多重作用, 這一重要發現對植物生物學具有重要意義.
有的受體激酶本身雖然識別小肽激素而非免疫分子模式, 但可以通過與免疫受體互作等方式在免疫中發揮重要作用. 浙江大學團隊發現, 植物磺化肽激素在番茄中發揮對灰黴菌的抗病作用, 而植物生長素和鈣信號在這一新的免疫途徑中起到了重要作用. 福建農林科技大學的團隊發現, GPI-鉚定蛋白LLG1在模式識別受體介導的免疫中發揮重要作用, 暗示了小肽激素受體與免疫受體的互作.
PRR受體的活性受到轉錄、磷酸化、泛素化、內吞等多重調控. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究組發現了一個由microRNA和轉錄抑制因子組成的通路, 特異控制模式識別受體FLS2編碼基因在發育過程中的轉錄. 中山大學的團隊發現, 幾丁質共受體CERK1特異酪氨酸磷酸化位點在其活性調控中發揮關鍵作用; 這一活性調控需要與之互作的磷酸酶CIPP1參與, 形成了一個精細調控環路.
1.4 在免疫信號轉導機製取得廣泛進展
我國學者在模式識別受體的下遊調控組分的研究中取得了一系列重要突破. 北京生命科學研究所和中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊發現, 定位於胞質的類受體激酶BIK1和多個同源蛋白PBLs直接與多個模式識別受體互作, 介導免疫反應. 這些激酶是模式識別受體途徑中的核心組分, 直接磷酸化下遊的多個重要信號組分, 包括定位於質膜的NADPH氧化酶RbohD、MAPK級聯通路的激酶MAPKKK3/5、異源三聚體G蛋白調控蛋白RGS1等, 從而激活免疫活性氧生成、MAPK級聯通路以及異源三聚體G蛋白, 正調控植物免疫, 對病原細菌和真菌的抗性發揮重要作用; 此外, BIK1對激發子激活的鈣信號也發揮關鍵作用; BIK1蛋白本身也受到由異源三聚體G蛋白、泛素E3連接酶PUB25/26、依賴於激酶CPK28組成的蛋白穩態調控模塊的精細調控. 中國科學院植物生理與生態研究所團隊發現水稻中幾丁質受體途徑以類似的方式調控MAPK級聯通路. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊發現另一個胞質的類受體激酶BSK1在模式識別受體FLS2下遊發揮重要作用, 並能夠直接磷酸化MAPKKK5正調控MAPK級聯通路. 南京大學研究組與美國華人學者合作研究發現, PEPR通過陰離子通道SLAC1和SLAH3調控氣孔關閉, 發揮對細菌入侵的抗性.
植物免疫應答是一個異常複雜的生物學過程, 包括活性氧生成、MAPK級聯途徑、轉錄調控、蛋白質泛素化與穩定性調控、細胞死亡、次生代謝物產生等多個方面. 我國學者在植物免疫信號轉導研究中取得了一系列重要進展.
活性氧生成是植物免疫應答中的早期事件, 在植物免疫調控中發揮重要作用. 四川農業大學研究組結合遺傳學和全基因組關聯分析, 發現了水稻廣譜抗稻瘟病基因bsr-d1, 揭示了轉錄因子MYBS1結合bsr-d1啟動子操控活性氧水平和抗病性的分子機理. 中國農業科學院植物保護研究所研究組發現, 泛素連接酶SPL11與小G蛋白激活因子SPIN64以及SD-1類型受體激酶SDS25相互作用, 通過調控活性氧產生負調控水稻的細胞死亡和抗病性, 而Dynamin相關蛋白OsDRP1E6通過調控水稻細胞色素c從線粒體的釋放負調控水稻的程序性細胞死亡. 南京農業大學團隊發現, 光誘導水稻捕光複合物蛋白LHCB5磷酸化, 通過調控葉綠體活性氧積累增強水稻的稻瘟病抗性.
MAPK級聯通路是真核生物中保守的信號傳遞激酶, 控制氣孔運動、下遊基因轉錄、次生代謝物合成、細胞死亡等免疫反應. 我國學者發現MAPK等激酶參與植物免疫調控的多種功能和作用機理. 北京生命科學研究所團隊發現了擬南芥中由MEKK1, MKK1/MKK2和MPK4組成的植物免疫負調控的完整MAPK級聯複合物. 浙江大學團隊發現, 擬南芥MPK3/MPK6以及其上遊激酶MKK4/MKK5調控氣孔和質外體免疫. 中國農業大學的研究組與美國華人學者合作發現, 擬南芥MPK3和MPK6是介導camalexin合成的關鍵信號途徑. 中國農業科學院植物保護研究所團隊發現, 植物受到雙生病毒侵染後通過激活MAPK途徑來對抗病毒的侵染, 但雙生病毒衛星分子編碼的βC1蛋白能夠巧妙地通過靶標MKK2和MPK4來抑制MAPK介導的防禦, 從而有助於病毒侵染植物.
泛素連接酶通過泛素化修飾調控靶蛋白的降解、轉運和功能變化, 是控制免疫信號轉導的重要調控因子. 中國科學院植物生理與生態研究所團隊發現, 水稻E3泛素連接酶EBR1通過泛素化修飾OsBAG4調控水稻細胞死亡以及對細菌和真菌的抗病性; 他們還與浙江大學團隊合作發現, 另一個E3泛素連接酶OSBBI通過增強細胞壁防衛與ROS(reactive oxygen species)的生物合成調控對稻瘟病的廣譜抗性. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究組發現, E2連接酶UBC32調控大麥MLO-12蛋白的穩定性和白粉病抗性. 我國學者還發現了水稻、擬南芥和葡萄的多個E3泛素連接酶在植物免疫調控中的功能和作用機理.
大量防衛相關基因的誘導表達, 是植物免疫反應的重要特徵. 我國學者發現了WRKY, NAC, ERF, MYC, MYB, bHLH等多種轉錄因子參與植物免疫調控的功能和作用機理. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊發現, 番茄同源的NAC轉錄因子JA2和JA2L分別通過脫落酸和茉莉酸途徑差異化調控氣孔開閉和植物免疫反應. 中國科學院西雙版納熱帶植物園團隊發現, 擬南芥轉錄因子WRKY8通過調控ABI4, ACS6和ERF104的表達調控植物對病毒的免疫響應. 華南農業大學團隊發現, 水稻SWI/SNF2 ATP酶基因BRHIS1通過結合特異的泛素化組蛋白靶向防衛相關基因啟動子區域, 抑制防衛相關基因表達. 北京生命科學研究所研究組發現, TPR1可能通過結合組蛋白去甲基化酶HDA19抑制負調控因子DND1和DND2激活植物免疫反應; 發現WRKY70轉錄因子和importin-β超家族成員MOS14介導的NLR蛋白免疫信號傳遞新機制.
我國學者還在免疫相關程序性細胞死亡、細胞自噬以及轉錄組和蛋白組分析等方面取得了進展. 清華大學研究組發現, 同源蛋白ERD2a和ERD2b作為內質網腔蛋白受體調控蛋白質加工和植物細胞死亡. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所研究組分離了多個介導白粉病免疫調控的新組分, 揭示了細胞自噬、蛋白酶體途徑、MAPK激酶途徑調控白粉病免疫的分子機制, 為白粉病抗病性改良提供了新靶標. 此外, 對侵染轉錄組和蛋白質組的研究還發現了植物響應真菌和昆蟲免疫反應的轉錄組和蛋白質組差異, 鑑定了一批重要的植物免疫相關基因, 建立了植物防衛相關基因表達資料庫PlaD.
1.5 揭示了多種防衛相關激素參與免疫調控的分子機理
植物激素在植物免疫應答中發揮極其重要的作用. 茉莉素是關鍵的防衛激素之一, 對植物抵禦咬食性昆蟲和死體營養型病原菌尤其重要. 我國學者在茉莉酸生物合成和信號傳遞調控機制方向在國際上發揮了主導作用. 比如, 清華大學團隊發現, 昆蟲取食通過激活依賴於鈣信號的JAV1(Jasmonate associated VQ domain protein 1)磷酸化, 調控JAV1核質穿梭和降解, 激活茉莉酸的生物合成和積累, 從而誘導植物免疫. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊發現了細胞色素P450蛋白CYP82C2、MYC2轉錄因子及其磷酸化調控茉莉酸響應基因和植物抗蟲、抗病反應的新機制. 中國科學院上海植物生理生態研究所研究組發現, 依賴於苗齡的茉莉酸累積水平調控植物抗蟲性. 華南農業大學團隊發現了矽增強茉莉酸響應和茉莉酸促進矽積累的雙向調控機制.
水楊酸是另一個重要防衛激素,對植物抵抗活體、半活體營養型病原微生物起關鍵作用. 我國學者在水楊酸合成和應答研究中取得了多項進展, 北京生命科學研究所團隊發現, 轉錄因子CBP60g與SARD1通過結合ICS1基因的啟動子調控ICS1表達, 是調控水楊酸合成的核心轉錄因子. 武漢大學團隊發現了水楊酸通過抑制過氧化氫酶CAT2活性降低生長素合成和破壞CAT2與JA合成酶醯基輔酶A互作降低JA合成的調控機制. 中國農業科學院作物科學研究所研究組發現, 水稻磺基轉運酶OsSOT1催化水楊酸磺化生成磺化水楊酸, 促進水楊酸生物合成. 此外, 多個團隊還發現乙烯、油菜素內酯、生長素及其他激素信號途徑參與植物免疫調控的新機制. 比如, 北京生命科學研究所研究組發現, 乙烯信號途徑轉錄因子EIN3和EIL1與水楊酸合成酶SID2相互作用, 對水楊酸途徑形成拮抗.
2 病原基因組研究
病原菌基因組的測序與分析是農作物抗性改良設計的重要環節. 中國科學院微生物研究所團隊早在2005年就率先完成了野油菜黃單胞菌基因組全序列測序, 並利用比較基因組學和功能基因組學等先進手段, 系統地研究了其致病過程的基因, 從16512個突變體中, 實驗證實13類共75個基因參與致病過程, 為深入揭示植物細菌的分子致病機理, 為我國水稻以及其他農作物的細菌性病害的農業防治研究奠定了組學基礎. 此後, 我國科學家又先後主導完成了小麥條鏽菌、稻曲病菌、菟絲子等重大農作物寄生生物的全基因測序. 其中西北農林科技大學團隊主導測序獲得了小麥條鏽菌高質量基因組框架圖, 證實條鏽菌基因組存在高度雜合特徵; 通過基因組和比較基因組學方法揭示了遺傳重組是條鏽菌新菌系產生的重要途徑, 提示長期以來認為點突變是鏽菌致病性變異主要來源的觀念需要重新審視. 中國農業大學的團隊成功繪製出了稻曲病菌基因組序列草圖, 鑑定了一批潛在的致病因子, 並從基因組學角度提供了關於稻曲病菌進化、活體營養分子機制以及致病機制的新見解; 揭示出有關稻曲病菌進化、活體營養和致病分子機制的一些新認識, 進而為設計改良稻曲病抗性奠定了基礎. 中國科學院科研團隊破譯了寄生植物南方菟絲子的全基因組序列, 揭示其在進化中經歷了大規模基因丟失事件, 這些丟失的基因與寄生植物特殊的植物形態和生活方式有關, 該研究為深入探索寄生植物的演化和生理生態、設計田間防控寄生植物的策略提供了重要依據. 中國農業科學院科研團隊破譯了植物內生真菌的基因組並系統性鑑定了其分泌蛋白, 為進一步加深對農業和生態共生真菌的理解, 為解析農作物的促生與抗性的平衡機制提供了新見解.
鑑於一些重大農作物病原物自然變異快速, 開展自然群體菌株的重測序對理解病菌的變異規律和設計植物持久抗性具有重大意義. 我國科學家的代表性工作包括: 南京農業大學團隊以我國水稻產區主要流行的稻瘟菌株為研究材料, 綜合採用組學和分子遺傳學方法, 證實菌株特異性基因的自然存在是稻瘟病菌群體變異的重要原因之一, 是克服品種抗性和抵禦不良環境的重要遺傳方式; 中國農業大學團隊通過對稻瘟病菌野生菌株與實驗室菌株基因組比較發現, 野生菌株出現基因擴張, 其中部分基因影響毒性和無性階段發育, 揭示了遺傳因子在稻瘟菌基因組變異中的貢獻, 這些研究對認識稻瘟病菌的變異機制及利用抗病品種控制稻瘟病具有積極的指導價值; 通過蛋白組學分析揭示了SUMO修飾在稻瘟菌附著胞侵染中的重要功能. 近年來, 我國科學家還在重大植物病原菌表觀基因組研究中取得突破. 南京農業大學團隊系統性地開展了馬鈴薯晚疫病菌和大豆疫病菌全基因組甲基化研究, 繪製了第一幅卵菌的表觀修飾圖譜, 鑑定了驅動其修飾的酶, 這些研究將為進一步解析疫黴菌田間致病、變異機制提供理論基礎. 西北農林科技大學科研團隊以小麥赤黴病菌為研究對象發現, A-to-I的RNA編輯是絲狀子囊真菌中的一種保守表觀遺傳調控機制, 測序鑑定出了400多個進化保守的編輯位點, 初步揭示了其背後的生物學功能, 有望為提升植物抗性、設計新型赤黴病控制策略提供理論依據.
3 病原效應蛋白研究取得多項突破
病原效應蛋白研究是植物免疫學研究近十幾年的熱點領域之一. 病原生物的效應蛋白是重要的致病因子, 能通過多種方式幹擾植物的免疫反應, 促進病原侵染、擴展以及定殖; 病原效應蛋白也是植物PRR受體和NLR受體識別的對象. 我國科學家在該領域的研究目前處於國際前沿.
3.1 我國引領病原細菌效應蛋白致病機理研究
植物病原細菌分泌效應蛋白進入植物細胞內, 通過多種多樣的生化活性操控植物的免疫和生理反應. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所和北京生命科學研究所研究組揭示了病原細菌多個效應蛋白的致病功能、宿主靶標和生化機理, 在國際上率先提出了植物免疫識別的「誘餌模型」, 引領了細菌效應蛋白致病機理的研究, 為研究其他病原的效應蛋白提供了範本. 研究發現, 假單胞菌三型分泌系統的一個主要功能是抑制宿主植物的PTI免疫反應, 其分泌的多個效應蛋白都具有對PTI的抑制功能. 揭示了效應蛋白AvrPto通過激酶抑制子活性抑制模式識別受體FLS2的激酶活性, 從而幹擾植物免疫反應的機理; 發現了效應蛋白AvrPphB通過半胱氨酸蛋白酶活性切割植物模式識別受體途徑核心組分BIK1, 阻斷免疫信號的分子機制; 同海南大學研究組合作發現, 野油菜黃單胞菌效應蛋白AvrAC是一個全新的酶-尿苷磷酸轉移酶, 能特異地修飾BIK1及其同源蛋白, 抑制BIK1的激活, 從而阻斷免疫信號途徑; HopB1通過絲氨酸蛋白酶活性切割植物免疫共受體BAK1; HopAI1通過磷酸化蘇氨酸裂解酶活性去磷酸化MAPK激酶, HopF2通過核糖基轉移酶活性修飾MAPKK激酶, AvrB通過與RAR1互作, 激活MAPK激酶MPK4調控茉莉酸信號途徑等多種效應蛋白致病機制. 其中, AvrPto、AvrPphB、和AvrAC毒性機制的發現, 為植物免疫的誘餌模型提供了證據. 此外, 江蘇農業科學院的研究組與美國華人學者合作研究發現, AvrPtoB還能利用其E3泛素連接酶的活性靶向水楊酸信號途徑的關鍵蛋白NPR1, 幹擾植物的免疫. 中國科學院微生物研究所團隊在白葉枯細菌效應蛋白中發現了一個新的E3泛素連接酶, 在毒性功能中發揮關鍵作用.
清華大學團隊利用結構生物學手段, 發現了假單胞菌效應蛋白AvrPto和AvrPtoB均具有激酶抑制子的活性, 為它們的作用方式提供了生化與結構證據. 黃單胞菌等植物病原細菌編碼一類獨特的TALE效應蛋白, 該類蛋白進入植物細胞後, 能直接結合特異的啟動子序列進而激活植物感病基因的表達. 清華大學團隊利用結構生物學手段, 完美解析了TALE結合特異DNA鹼基的機制. 上海交通大學團隊通過與美國華人學者合作發現, 白葉枯細菌分泌一種缺失轉錄激活結構域的非典型TALE蛋白, 能識別水稻抗病基因Xa1的啟動子並幹擾Xa1的表達, 使得水稻喪失抗性.
3.2 病原卵菌效應蛋白致病機理研究取得重大突破
同病原細菌一樣, 真核病原微生物也能向宿主植物細胞內或細胞間分泌效應蛋白. 南京農業大學團隊在大豆疫黴菌效應蛋白致病機理研究方向取得了系列研究成果. 通過對疫黴菌轉錄組分析、效應蛋白單倍型分析和功能鑑定, 揭示了效應蛋白協同作用致病的新機制, 並在隨後的研究中闡明了多個效應蛋白的重要作用和分子機制. 研究發現, 大豆疫黴菌胞間效應蛋白XEG1通過其糖苷水解酶活性促進致病性, 同時可以作為類PAMP的效應蛋白被植物識別; 植物GIP1蛋白結合XEG1, 抑制其水解酶活性並激活免疫反應, 而大豆疫黴菌則進一步演化出與XEG1結構類似但不具有酶活的XLP1蛋白, 以此擾亂植物的識別, 掩護XEG1對植物的攻擊, 揭示了病原菌攻擊寄主的「誘餌模式」新策略; 發現胞內效應蛋白Avr3b通過Nudix水解酶活性降解ADPR, NADH等信號分子, 進而抑制植物免疫, 其活性依賴於植物親環素, 揭示了病原蛋白利用宿主因子加工進而發揮毒性功能的新機制; 發現Avh262通過穩定植物內質網蛋白BiP, 緩解內質網壓力引起的細胞壞死, 從而促進大豆疫黴侵染; 發現效應蛋白Avh23和Avh52通過調控寄主染色質組蛋白的乙醯化修飾, 進而精確地抑制抗病基因表達, 促進感病基因的表達, 從而在表觀修飾水平有效地幹擾植物免疫反應的機制; 與中國科學院上海植物逆境中心研究組合作, 解析了大豆疫黴效應蛋白Avh240的晶體結構, 並鑑定到了一個植物胞外免疫的新成員GmAP1, 揭示了大豆疫黴菌抑制GmAP1外泌的這一幹擾植物胞外免疫的新機制; 發現了疫黴菌產生3-磷酸磷脂醯肌醇可以幫助其侵染, 促進RXLR效應蛋白進入宿主細胞, 揭示了3-磷酸磷脂醯肌醇在植物與疫黴互作過程的重要作用; 發現疫黴菌分泌一類具有結合寄主DNA活性的效應因子, 通過與植物基因啟動子結合幹擾寄主防衛相關基因的表達, 從而破壞植物抗性; 與江蘇省農業科學院農業生物技術研究所合作發現, 大豆疫黴菌與大麗輪枝菌共有的一類非典型的效應蛋白通過水解水楊酸的前體分支酸, 阻礙水楊酸積累從而促進病菌致病力; 發現大豆疫黴菌效應蛋白PsAvr3c與大豆GmSKRP蛋白互作重編程寄主的pre-mRNA可變剪切過程, 從而促進大豆疫黴侵染; 揭示了病原菌在RNA剪切水平上調控寄主免疫反應的一種新機制. 此外, 西北農林科技大學研究組發現了辣椒疫黴效應蛋白PcAvr3a12通過靶向ER定位的脯氨醯異構酶, 幹擾宿主免疫的機制; 南京農業大學團隊通過一個辣椒疫黴致病關鍵效應蛋白RxLR207的靶標篩選, 鑑定到在抗病中起重要作用的新型免疫調控因子BPA1/BLPs.
3.3 發現了病原真菌免疫逃逸新策略
我國學者在稻瘟病菌和大麗輪枝菌等病原真菌效應蛋白研究中取得了一系列重要進展. 中國農業科學院植物保護研究所團隊發現了稻瘟菌效應蛋白AvrPiz-t通過靶向水稻的泛素蛋白酶體途徑、鉀離子通道以及轉錄因子等多種策略抑制水稻的基礎防衛反應. 中國農業大學的團隊發現了稻瘟真菌中的一種糖基轉移酶ALG3, 通過糖基化修飾關鍵效應蛋白Slp1, 幫助真菌逃避水稻免疫系統的識別; 鑑定了稻瘟真菌中與毒性相關的特異幾丁質酶並解析了其蛋白結構. 中國科學院微生物研究所團隊發現, 稻瘟菌分泌蛋白MoChia1可以結合真菌細胞壁幾丁質組分並抑制其激活的水稻免疫響應, 而水稻質膜蛋白OsTPR1通過破壞與MoChia1的結合幹擾病菌對植物免疫的抑制; 發現大麗輪枝菌效應蛋白VdPDA1通過去乙醯化酶活性, 改變其幾丁質結構, 從而逃避宿主植物對真菌的識別這一全新機制; 揭示了大麗輪枝菌分泌蛋白VdSCP41直接操控植物鈣調素結合蛋白家族重要免疫轉錄因子的致病機理; 發現大麗輪枝菌胞間效應蛋白VdSSEP1是一個絲氨酸蛋白酶, 該蛋白可抑制幾丁質酶Chi28對病原菌細胞壁的降解從而降低植物對病菌的免疫識別, 而富半胱氨酸的效應蛋白CRR1通過結合Chi28阻礙其對病原菌細胞壁的降解, 從而增強棉花的免疫防禦. 中國科學院上海植物生理生態研究所研究組發現禾穀鐮孢菌的新型致病因子鐮孢菌素A, 它是首個線性非核糖體肽類植物致病因子; 進一步研究表明, 鐮孢菌素A可能通過調控胞間連絲開閉和抑制葉綠體光合相關活性, 促進鐮孢菌菌絲在小麥細胞間擴展和赤黴病的發生.
3.4 昆蟲和線蟲效應蛋白研究取得進展
昆蟲和線蟲等動物病原也具備向宿主植物細胞分泌蛋白的能力, 但其分離鑑定較為困難. 我國學者在棉鈴蟲、病原線蟲以及稻飛蝨效應蛋白的研究中取得了進展. 中國科學院上海植物生理生態研究所研究組發現, 棉鈴蟲分泌的效應蛋白HARP1(helicoverpa armigera R-like protein 1)通過與COI1蛋白競爭性結合JAZ蛋白, 調控JAZ蛋白穩定性和茉莉酸信號途徑. 華南農業大學研究組與國外科學家合作發現, 線蟲分泌的效應蛋白MjTTL5靶向鐵氧還原蛋白催化亞基AtFTRc, 調控植物ROS清除能力和基礎免疫. 浙江大學團隊發現了煙粉蝨分泌Bt56進入植物, 並通過激活植物水楊酸信號途徑促進昆蟲存活和繁殖的機制, 還發現褐飛蝨唾液中的β-1,4糖苷酶可以作為效應蛋白抑制水稻免疫反應的形成. 武漢大學團隊分析了褐飛蝨取食水稻時的分泌物, 鑑定到一批飛蝨唾液蛋白為潛在的重要效應蛋白, 針對其中的黏蛋白NIMLP開展進一步研究發現, 該蛋白可誘導水稻細胞死亡、防禦相關基因的表達以及胼胝質沉積, 揭示了褐飛蝨唾液蛋白影響褐飛蝨的取食行為並誘發水稻免疫反應的機制. 南京農業大學團隊發現, 灰飛蝨唾液中的DNase Ⅱ抑制植物胼胝質形成和過氧化氫積累. 這些研究揭示了植物與昆蟲互作的分子機制, 為農作物抗蟲育種提供了重要理論依據與新穎的思路.
4 植物與病毒互作機制研究
RNA沉默或RNA幹擾(RNA interfering, RNAi)機制是植物抵抗病毒入侵的主要途徑. 病毒複製過程中形成的雙鏈中間體、雙向轉錄形成的雙鏈結構以及病毒轉錄本摺疊形成的局部雙鏈, 都能夠被植物RNAi系統識別並降解, 實現在轉錄水平或轉錄後水平對病毒基因表達的抑制, 進而抑制病毒侵染. 在植物與病毒長期協同進化中, 病毒為了抵抗植物抗病毒RNAi途徑, 獨立進化出功能多樣的RNAi沉默抑制子(viral suppressors of RNA silencing, VSR), 作用在植物RNAi途徑的各個階段進而抑制植物抗病毒RNAi. 我國科學家在植物-病毒互作領域的研究工作處於領先地位.
4.1 我國引領植物抗病毒小RNA途徑與VSR研究
除了直接識別並剪切病毒雙鏈RNA, 植物RNAi機制也通過其他途徑調控植物-病毒互作. 北京大學團隊針對病毒感染後的宿主小RNA積累、功能和作用機制進行了系統研究. 通過與清華大學和福建農林大學團隊合作發現, 水稻AGO18通過競爭性結合miR168保護AGO1蛋白, AGO1蛋白在抗病毒RNAi過程中發揮重要作用, 進而增強水稻抗病毒防禦反應; 通過與中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊合作發現, 單子葉植物特有的miR528能夠被AGO18競爭性地結合, 調控植物體內活性氧積累, 啟動下遊抗病毒通路; 通過與福建農林科技大學的團隊合作研究發現, 水稻條紋葉枯病病毒(rice stripe virus, RSV)蛋白NS3與水稻OsDRB1蛋白互作並發揮支架蛋白作用, 促進多個miRNA(microRNA)成熟, 導致植物抗病性下降; 近期, 通過與福建農林科技大學的團隊合作發現, 水稻miR528的轉錄受Squamosa promoter binding protein(SPL)轉錄因子家族的SPL9調控, 病毒侵染後通過抑制SPL9的蛋白水平下調miR528前體的轉錄表達; 通過與美國華人學者合作發現了病毒感染後除了病毒-特異的siRNA(short interfering RNA),還大量積累靶向內源基因的siRNA, 其機制獨立於其他內源小RNA, 提示存在尚不為人知的抗病機制. 此外, 福建農林科技大學與北京大學聯合研究組揭示了miR319參與調控水稻鋸齒葉矮縮病毒(rice ragged stunt virus, RRSV)的致病機制. 中國科學院微生物研究所團隊發現, 油菜miRNA1885受蕪菁花葉病毒(turnip mosaic virus, TuMV)侵染誘導表達, 並能夠靶向沉默植物抗性基因.
病毒VSR是病毒侵染植物所必需的關鍵因子. 中國科學院微生物研究所團隊發現, 菸草RNAi途徑重要蛋白RDR1具有沉默抑制子功能. 在對黃瓜花葉病毒(cucumber mosaic virus, CMV)編碼的沉默抑制子CMV2b蛋白的研究中, 鑑定到一個RNA結合結構域、一個RNAi途徑重要組分AGO蛋白結合結構域以及核仁定位信號, 並發現CMV2b沉默抑制子功能依賴於其RNA結合結構域; 與澳大利亞華人學者合作, 首次從分子水平證實CMV病毒衛星RNA起源於宿主植物. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊發現, 雙生病毒甜菜嚴重曲頂病毒(beet severe curly top virus, BSCTV)編碼的C2蛋白與植物SAMDC1蛋白互作並抑制26S蛋白酶體介導的SAMDC1蛋白降解, 進而影響植物對自身基因組以及病毒基因組的從頭甲基化過程, 從而影響植物RNAi抗病毒機制. 中國農業科學院植物保護研究所團隊對雙生病毒中國番茄黃曲葉病毒(tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)的研究發現, 菸草E3泛素化連接酶NtRFP1能夠介導TYLCCNV衛星DNA編碼的沉默抑制子βC1泛素化, 以及26S蛋白酶體對βC1的降解, 減弱病毒對植物的危害.
VSR蛋白也能夠直接與宿主蛋白互作, 影響植物的生長發育或免疫. 中國農業科學院植物保護研究所與清華大學聯合團隊發現, 蕪菁黃葉病毒(turnip yellow mosaic virus, TYMV)編碼的沉默抑制子P69能夠與轉錄因子GLK互作, 引起擬南芥亮黃色花葉病症. 由清華大學、中國科學院動物研究所、美國華人學者組成的合作團隊發現, CMV2b蛋白能夠靶向JA信號通路蛋白, 抑制JA信號, 揭示了病毒通過影響激素信號來操縱宿主對昆蟲媒介吸引力的分子機制. 中國農業大學團隊研究表明, 大麥條紋花葉病毒(barley stripe mosaic virus, BSMV)編碼的沉默抑制子γb被招募到病毒複製位點, 促進病毒複製; 與南京師範大學團隊合作發現, γb蛋白能夠與葡萄糖氧化酶互作, 抑制ROS產生從而促進病毒侵染. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊發現, BSCTV編碼的C4蛋白通過誘導植物E3連接酶RKP表達, 調控細胞周期抑制蛋白ICK1/KRP1的降解, 進而促進病毒侵染. 北京大學研究組發現, 水稻矮縮病毒(rice dwarf virus, RDV)外殼蛋白P2靶向貝殼衫稀氧化酶下調赤黴素合成影響植物生長, 此外P2通過與生長素信號通路的OsIAA10相互作用, 抑制OsIAA10的降解從而阻斷生長素信號通路, 參與RDV介導的水稻矮化表型的形成; 而另一個蛋白Pns11則通過刺激乙烯合成途徑中的SAMS酶活, 增強其感染能力. 中國農業科學院植物保護研究所研究組和浙江大學研究組合作發現, 中國番茄黃化曲葉病毒(TYLCCNV)的致病因子βC1蛋白通過上調rgs-CaM表達, 抑制植物RDR6促進病毒致病力, 同時rgs-CaM還可以與SGS3互作並通過細胞自噬途徑介導SGS3的分解. 清華大學團隊發現, 木爾坦棉花曲葉病毒(cotton leaf curl multan virus, CLCuMuV)衛星分子編碼的毒性因子βC1通過與NbSKP1蛋白互作, 抑制SCF複合物E3連接酶活性, 增強侵染力. 江蘇農業科學院和南京農業大學合作鑑定了一個參與植物發育和抗病的重要lncRNA, 發現番茄黃化曲葉病毒的siRNA與寄主中此lncRNA互作決定病毒的症狀發生, 而抗病品種的lncRNA通過變異逃脫siRNA的識別.
4.2 植物細胞自噬抗病毒研究取得進展
5 免疫與生長平衡
傳統認為, 植物的免疫與生長發育往往相互拮抗, 因此農作物抗病性的增強往往制約作物產量與品質的提高. 如何協調免疫與生長發育的平衡是未來植物性狀改良面臨的重大問題. 我國科學家近年來在水稻免疫與生長平衡機制研究領域取得了突破性的進展. 四川農業大學的研究組與中國科學院遺傳與發育生物學研究所的團隊合作發現, 水稻理想株型建成的核心調控因子IPA1同時對水稻免疫具有正調控功能. 稻瘟病菌侵染迅速誘導IPA1的DNA結合域磷酸化, 增強與抗性基因WRKY45啟動子的結合, 激活WRKY45基因表達和水稻免疫; 之後IPA1回復到非磷酸化狀態, 激活生長發育相關基因促進植株生長和產量. 這一重要發現揭示了IPA1協調水稻免疫和生長發育的平衡的分子機制. 南京農業大學的團隊也發現, 人工誘導IPA1的表達能夠同時促進水稻產量和抗病性. 中國科學院植物生理與生態研究所團隊發現了功能拮抗的NLR蛋白PigmS和PigmR協調免疫和生長發育平衡的分子機制. 表觀遺傳機制調控PigmS在穗部高表達, 通過競爭性結合破壞PigmR同源二聚體形成, 降低對水稻產量的影響; 在葉片和莖稈低表達保障PigmR的免疫功能. 這些發現揭示了農作物平衡免疫和生長發育的機制, 為農作物高產高抗品種的分子育種設計提供了新思路.
植物激素在植物免疫與生長的協調中發揮重要作用. 中國科學院植物生理與生態研究所團隊系統解析水稻防衛激素與發育激素間的交互作用, 以及單雙子葉模式植物間防衛激素信號的異同. 通過分析水稻中的赤黴素代謝酶基因發現, 赤黴素對水稻抗病性發揮抑制作用; 隨後通過與美國華人學者合作發現, JA信號可以直接抑制GA發育信號, 並發現了一個由COI1, JAZ, DELLA, PIF蛋白組成的關鍵信號模塊, 使得植物在需要動員防衛反應時, 抑制GA介導的生長發育, 揭示了單雙子葉植物中均保守的免疫-生長拮抗機制. 華中農業大學團隊發現由水稻GH3-8編碼的生長素代謝酶促進對白葉枯病的抗性, 這一作用不依賴已知的防衛激素.
在植物與微生物共生領域, 中國科學院植物生理與生態研究所研究組發現, 植物與菌根真菌共生過程中, 脂肪酸是菌根真菌獲取植物碳源營養的主要形式; 植物在與白粉病原真菌互作過程中, 脂肪酸也是病原真菌的碳源, 降低植物脂肪酸的合成可以抑制病原真菌致病力. 豆科植物與根瘤菌的共生及固氮是一個耗能的過程, 該所另一研究組通過對蒺藜苜蓿NIN-like protein基因家族調控共生互作的研究, 揭示了豆科植物響應環境硝酸鹽信號, 抑制根瘤形成及固氮, 從而降低植物能耗的分子機制. 植物與微生物共生機制的研究將為調控植物免疫與生長發育的平衡提供新的思路.
6 抗病蟲基因的分離鑑定和抗病蟲育種
農作物抗病蟲基因的分離鑑定, 不僅直接服務於農作物品種改良和抗病蟲綠色防控, 而且在植物免疫理論的建立和發展中發揮了先行作用. 我國學者通過長期耕耘, 在農作物抗病蟲基因的分離鑑定方向做出了卓越貢獻. 早在20世紀90年代, 中國科學院遺傳研究所團隊通過對分子標記的研究, 對分離鑑定第一個水稻抗白葉枯基因Xa21作出重要貢獻.Xa21成為植物免疫受體的一個重要代表. 進入21世紀以來, 我國學者充分利用分子遺傳學與基因組學手段, 在分離鑑定農作物重大病蟲害抗性基因方面取得快速進步, 先後分離到一大批重要抗性基因, 為推進病蟲害防控提供了新手段, 為深入研究免疫機制奠定了基礎. 其中最為突出的工作包括水稻抗白葉枯、抗稻瘟病、抗水稻飛蝨、小麥抗白粉病及赤黴病以及玉米抗病基因的分離鑑定.
水稻白葉枯、稻瘟病和條紋葉枯病分別是水稻生產中危害最大的細菌、真菌和病毒病害. 我國學者分離鑑定到多個水稻白葉枯抗性基因, 產生了重大影響. 華中農業大學團隊發現, 水稻白葉枯抗性基因Xa26和Xa4均編碼類受體激酶, 表明了跨膜受體激酶在抗水稻白葉枯病中的重要作用; 首次分離鑑定到了抗白葉枯的隱性抗病基因xa13, 為解析水稻和白葉枯致病細菌間的獨特互作機制提供了重要線索. 中國農業科學院作物科學研究所的團隊分離鑑定到了高抗白葉枯的廣譜持久抗性基因Xa23. 我國學者還分離鑑定到了一批具有重要價值的抗稻瘟基因, 主要編碼NLR類型的免疫受體. 中國科學院植物生理生態研究所團隊發現, 水稻中成對的NLR基因PigmR和PigmS共同決定抗性, 該項成果揭示了廣譜抗稻瘟基因的調控機制, 產生了重大影響. 在另外一項同樣重要的工作中, 四川農業大學的團隊分離鑑定到一個廣譜持久抗稻瘟基因bsr-d1, 該基因編碼一個C2H2型轉錄因子並通過控制活性氧積累促進抗病. 中國農業科學院團隊分離鑑定到了首個抗水稻條紋葉枯病基因STV11, 發現其編碼磺基轉移酶, 以獨特的方式決定水稻的抗病性. 這幾項成果是我國近年來在水稻廣譜抗病研究中取得的重大突破.
水稻飛蝨不僅直接危害水稻生長, 還是重要的病毒傳播媒介, 對我國南方水稻生產是重大威脅. 武漢大學研究組在國際上率先分離鑑定到編碼NLR蛋白的抗褐飛蝨基因Bph14、編碼NLR蛋白的抗飛蝨基因Bph9以及編碼胞吐囊泡蛋白的基因Bph6. 南京農業大學的團隊分離鑑定到了編碼類受體激酶的廣譜、持久抗飛蝨基因Bph3. 這些工作奠定了我國在世界抗稻飛蝨研究領域的優勢地位.
小麥生產中受到白粉病、赤黴病、條銹病等重要病害的侵染, 但受制於小麥基因組的複雜性, 小麥抗病基因一直難於分離. 南京農業大學的學者經長期努力, 成功分離鑑定到小麥抗白粉病基因Pm21和Pm60, 發現它們分別編碼蛋白激酶和NLR受體蛋白. 小麥赤黴病嚴重威脅全球小麥安全生產, 由於赤黴病的抗原匱乏, 其防治極其困難, 因此赤黴病有小麥癌症之稱. 南京農業大學團隊與美國華人學者近期同時成功分離鑑定到首個中抗赤黴病的抗病基因fhb1, 並發現其是一個隱性抗病基因. 浙江大學團隊發現, 生防細菌綠針假單胞菌分泌吩嗪-1-甲醯胺進入赤黴病菌細胞, 與其組蛋白乙醯轉移酶Gcn5結合抑制赤黴病菌的組蛋白乙醯化, 從而抑制病菌生長、毒素合成和致病力, 為抗赤黴病微生物殺菌劑研發提供了新 視角. 條銹病對小麥主產區是一個長期威脅. 西北農林科技大學的團隊與國外研究組合作, 分離鑑定到抗條鏽基因Yr10, 發現其編碼一個典型的NLR受體蛋白.
此外, 中國農業大學團隊在玉米抗甘蔗花葉病毒和抗黑穗病基因的分離鑑定中也取得了突破, 發現玉米抗甘蔗花葉病毒基因Scmv1和黑穗病數量抗性基因qHSR1分別編碼硫氧蛋白還原酶和類受體激酶, 為研究這兩個玉米病害的抗性機制奠定了基礎.
我國作物抗病蟲育種已有近60年的歷史, 是作物高產穩產的主要目標性狀. 從20世紀的國家科技攻關「六五」計劃開始, 圍繞水稻抗稻瘟病、白葉枯病、褐飛蝨、小麥赤黴病、銹病等開展了卓有成效的抗病遺傳研究和育種工作, 利用常規雜交和遠緣雜交分別育成了大批抗病骨幹親本和品種, 使我國在水稻和麥類抗病育種上趨於國際領先地位. 比如, 我國水稻育種家通過對農家品種的篩選, 發現了水稻抗稻瘟廣譜抗性基因Pigm,bsr-d1和水稻抗白葉枯廣譜抗性基因Xa4等重要基因; 廣西農業科學院、中國農業科學院等研究機構通過遠緣雜交, 將普通野生稻和疣粒野生稻的抗稻瘟病和白葉枯病基因導入栽培稻, 培育出一批抗病新品系. 在小麥抗病育種方面, 率先在世界上建立了抗赤黴病育種技術體系, 篩選出望水白等高抗赤黴病資源, 利用雜交育種育成高抗赤黴病小麥品種蘇麥3號, 攜帶fhb1和其他抗性位點; 李振聲先生、李晴祺先生和劉大鈞先生等人利用遠緣雜交結合染色體工程手段, 分別從偃麥草、黑麥、簇毛麥成功導入高抗條銹病、白粉病等多個病原菌的骨幹親本, 並培育出小偃系列等一系列重要抗病品種. 近十幾年, 我國育種家通過多基因聚合, 在廣譜抗病蟲育種上取得了實質性進展, 育成多個廣譜抗稻瘟、抗白葉枯和抗褐飛蝨水稻品系, 育成揚麥系列高產抗白粉病小麥品種.
7 植物病蟲害防控與生物技術
對植物-病原生物和植物-昆蟲互作機制的深入研究, 催生了一系列精準設計與改良農作物抗病蟲性狀的生物技術. 我國學者的工作, 有力地推動了基於小RNA的抗病蟲技術和基於基因編輯的抗病技術發展.
7.1 小RNA技術與農作物抗病蟲防控
雖然小RNA對植物抗病的作用最早是在抗病毒研究中發現的, 但隨後的大量研究表明, 宿主植物中的多種內源RNA生成, 在對真菌、卵菌以及動物病原生物的抗性中發揮重要作用. 這些研究不僅揭示了植物內源小RNA對防衛反應和生長發育關鍵基因的新的調控機制, 還揭示了小RNA在宿主與病原生物間的跨界轉運, 發現了植物針對病原生物的新「武器」. 此外, 近年美國華人學者金海玲研究組發現, 病原生物也同樣能向宿主植物細胞內轉運小RNA, 這些小RNA被當作武器攻擊植物的防衛系統. 我國學者的研究為植物與病原生物互作中的小RNA跨界轉運提供了重要證據. 此外還發現了多個與植物抗病或病原致病相關的小RNA. 這些研究不僅拓展了對抗病/感病機制的認識, 還為抗病生物技術的發展帶來了新機遇.
中國科學院植物生理與生態研究所團隊構建了棉花中表達棉鈴蟲的細胞色素單氧酶P450基因(CYP6AE14)的 dsRNA(double-stranded RNA), 餵食棉鈴蟲後顯著降低其CYP6AE14的表達, 提升了棉花對棉鈴蟲的抗性. 這一技術也稱為HIGS(host-induced gene silencing). 中國科學院微生物研究所團隊通過HIGS技術在棉花中表達靶向大麗輪枝菌致病基因VdH1的小RNA, 從而特異性地在響應大麗輪枝菌侵染過程中沉默大麗輪枝菌VdH1, 成功提高了棉花對大麗輪枝菌的抗病性. 這些研究為利用小RNA技術進行農作物抗病蟲改良提供了良好的範例, 也暗示了植物與病蟲生物間的小RNA跨界轉運. 中國科學院微生物研究所團隊進一步用實驗生物學手段, 驗證了小RNA由植物細胞向大麗輪枝菌轉運這一假說. 西北農林科技大學的團隊發現, 來自小麥條銹病菌的小RNA Pst-milR1對其致病力有重要作用, 利用HIGS手段沉默該小RNA編碼基因可增強小麥對稈鏽菌的抗性; 利用HIGS對條鏽菌的蔗糖酶基因、激酶基因PsCPK1和PsFUZ7進行沉默, 在小麥中獲得了對條鏽菌的抗性. HIGS的成功應用, 有賴於對病原生物重要靶點的發現. 最近, 西北農林科技大學團隊在小麥赤黴病致病菌禾穀鐮孢菌中發現一類新的GPCR(G-protein-coupled receptor), 在致病生物學過程中發揮特異作用, 這些基因有可能成為利用HIGS技術防治赤黴病的重要靶點. 隨著病原生物更多重要靶點的發現, HIGS的應用具有廣闊前景.
7.2 感病基因與基因編輯技術
與大多數抗病基因不同, 華中農業大學的研究組發現水稻抗病基因xa13為隱性抗病基因. 進一步分析發現, 其與感病等位基因Xa13的編碼區完全相同, 而僅僅在啟動子區有差異. 隨後的分析發現,Xa13蛋白定位於質膜, 具有轉運蛋白活性.Xa13啟動子被白葉枯細菌中具有轉錄因子活性的特異TALE(transcription activator-like effector)效應蛋白結合後表達, 而xa13的啟動子則逃避了TALE效應蛋白的結合, 因此不表達, 表現為「抗病」.Xa13為廣泛存在於不同植物中的糖轉運蛋白, 其誘導表達, 能為細菌提供更多的養分. 隨後的工作還發現了一個水稻中特異的轉錄因子, 被細菌的TALE效應蛋白利用, 控制植物感病基因的表達. 最近在小麥中發現的赤黴病抗病基因fhb1很有可能也是由感病基因突變產生而來. 中國科學院植物生理與生態研究所團隊發現, 水稻中的OsGLIP1/2酯酶基因和OsBON1/3基因在病原菌感染中很可能也發揮感病基因的作用. 浙江大學的團隊與國外學者合作發現, 水稻中的細胞色素P450基因CYP71A1能合成5-羥色胺, 對褐飛蝨侵害有利; 在水稻中沉默或突變該基因則能導致對褐飛蝨抗性. 這些研究提示了通過生物技術下調或敲除感病蟲基因, 從而改良農作物抗性的新策略.
感病基因概念的提出, 對抗病蟲生物技術的發展具有重要意義. 我國利用基因編輯技術, 針對感病基因進行農作物抗病改良率先取得了重大突破. 中國科學院遺傳與發育生物學研究所與微生物研究所團隊合作, 在六倍體小麥中利用基因組編輯技術敲除了感病基因MLO的3個拷貝, 使小麥獲得對白粉病持久和廣譜抗性. 相關論文被Nature Biotechnology選為該期刊20周年最具有影響力的20篇論文之一, 入選麻省理工科技評論的「2016年十大技術突破」. 此外, 中國科學院遺傳與發育生物學研究所團隊合作對小麥感病基因TaEDR1進行基因編輯, 也獲得了中抗白粉病的六倍體小麥植物. 類似的研究在柑橘抗潰瘍病的材料創製中也取得了進展. 可以預見, 隨著感病基因研究的廣泛開展, 基因編輯技術將更多的用於抗病蟲改良.
8 機遇與挑戰
植物先天免疫概念於20世紀90年代末在國際上被正式提出. 隨著植物免疫受體和病原效應蛋白研究的開展, 植物免疫學基本完成了理論框架的構建和完善. 在此20年間, 我國植物免疫研究從無到有, 發展迅猛, 在抗病蟲基因分離鑑定、免疫受體作用機制、信號轉導、病原效應蛋白、植物-病毒互作以及抗病蟲生物技術等方向上為國際學術界做出了卓越的貢獻.
我國植物免疫學研究要更上一層樓, 需要進一步瞄準前沿重大科學問題. 比如, NLR蛋白是如何激活植物免疫的? 能否在率先解析植物抗病小體結構的基礎上, 抓住機遇, 通過人工設計合成抗病蛋白, 使得農作物獲得新的廣譜持久抗性? PRR受體與NLR受體間是什麼關係? 植物自身免疫如何受到動態調控? 作物免疫是否受到馴化選擇? 再如, 我國在病原效應蛋白研究中做出了大量工作, 未來能否進一步挖掘與之對應的免疫受體, 為農作物抗病蟲育種提供新的抗原? 通過對效應蛋白靶向的植物感病基因編輯, 進一步改良農作物的基礎抗性? 植物免疫反應最終是如何阻止病原生物的侵染或定殖的? 尤其值得關注的是, 2019年國際MPMI(Molecular Plant-Microbe Interactions)大會提出了植物-微生物互作9個重大科學問題: 植物在與有益微生物互作的同時, 如何限制病原微生物? 環境因素如何影響植物-微生物互作? 如何才能將植物免疫基礎研究應用到農作物抗病蟲害中去? 微生物-微生物間的互作如何影響植物-微生物互作? 非寄主抗性的分子基礎是什麼? NLR蛋白如何誘導細胞死亡? 為什麼有的病原微生物需要如此多的效應蛋白, 而有的卻需要很少? 病原菌如何產生新的毒性功能? 植物-微生物二元互作研究得到的發現在生態系統中是否能被證實? 我國學者今後將瞄準這些重大前沿科學問題與國際同行開展合作與競爭, 力爭在植物免疫基礎理論與作物抗性設計改良尋求重大突破.
植物免疫研究必須服務於我國農業可持續發展這一國家發展的戰略需求. 要實現這一目標, 仍然面臨著艱巨的挑戰. 與發達國家相比, 我國植物免疫的基礎研究隊伍與作物育種隊伍的結合目前還比較鬆散, 還有待進一步加強, 利用抗性品種有效防控病蟲害, 在實踐上仍存在多方面挑戰. 一是病原田間變異導致農作物抗性的頻繁喪失. 如何利用植物免疫學理論, 指導持久抗性基因的鑑定和應用? 如何結合高抗的NLR編碼基因和廣譜抗性的PRR受體編碼基因達到最佳防控效果? 如何預測田間流行毒性菌株, 把抗病品種布局和農藥的精準施用相結合? 我國對病原變異的研究相對薄弱. 令人欣慰的是, 西北農林科技大學和中國農業大學的團隊在小麥條鏽菌和稻瘟菌的基因組變異和毒性變異研究中做了大量工作, 並積累了寶貴經驗. 抗病育種的另一桎捁是缺乏可利用可利用的天然抗原. 包括小麥赤黴病、水稻稻曲病、柑橘黃龍病等重大作物病害, 在近緣物種中幾乎沒有抗病基因可用. 對於這些病害, 需要更好地挖掘非寄主抗性基因(尤其是編碼模式識別受體的基因), 或者開發基於基因操作的生物技術, 作為未來抗病蟲綠色防控的技術儲備. 此外, 對抗病基因的分離鑑定基本上還停留在從育種材料到單基因逐個鑑定和克隆的傳統分子遺傳學方法, 效率低下. 植物抗病基因的重要特點是其巨大的多樣性, 未來需要對抗病基因組以及基因組關聯分析給予更多關注, 在高效鑑定抗病基因方面, 充分利用抗病基因的多樣性, 更好地服務於抗病蟲育種.
過去20年, 我國植物免疫研究不僅產生了一大批高水平原創性成果, 還湧現出了一批領軍人才, 形成了多個優秀研究團隊. 我國學者已從先前的國際研究「跟跑者」, 逐漸成長為國際同行的「並跑者」, 與他們同臺競技, 甚至在植物免疫受體結構與功能、植物廣譜抗病等方向上已經成為了「領跑者」, 引領這些方向的創新性研究, 受到國際同行的高度關注。以此為新起點, 我國科學家將在植物免疫前沿研究中發揮更加重要的作用, 更好地服務於我國農作物抗病蟲綠色防控這一重大戰略需求.