Small Molecules Co-targeting CKIα and the Transcriptional Kinases CDK7/9 Control AML in Preclinical Models
作者：Waleed Minzel, Avanthika Venkatachalam, Avner Fink, Eric Hung, Guy Brachya, Ido Burstain, Maya Shaham, Amitai Rivlin, Itay Omer, Adar Zinger, Shlomo Elias, Eitan Winter, Paul E. Erdman, Robert W. Sullivan, Leah Fung, Frank Mercurio, Dansu Li, Joseph Vacca, Nathali Kaushansky, Liran Shlush, Moshe Oren, Ross Levine, Eli Pikarsky, Irit Snir-Alkalay, and Yinon Ben-Neriah(The Lautenberg Center for Immunology and Cancer Research, Institute of Medical Research Israel-Canada, Hebrew University-Hadassah Medical School, Jerusalem, Israel)
發表情況：Cell Volume 175, Issue 1, 20 September 2018, Pages 171-185.e25
急性髓細胞性白血病(Acute myeloid leukemia, AML) 是一種髓系造血幹/祖細胞惡性血癌，現金尚且沒有顯著臨床效果的靶向治療方案。前期研究發現抑制酪蛋白激酶1A1(CKIα) 可以激活p53，並且CKIα在「來那度胺」(Lenalidomide, 是沙立度胺的衍生物)治療MDS中起著重要作用，通過促進CKIα的降解，增加p53的穩定性，從而殺死白血病細胞。因此開發新型CKIα抑制劑是否能有效治療AML？
●研究人員開發了一種同時靶向CKIα和CDK7/9的口服活性小分子抑制劑；
●晶體學分析為共靶向不同激酶的作用提供了結構基礎；
●這種抑制劑可以選擇性殺死AML前體細胞並治癒AML小鼠；
●治療的機理包括p53激活以及超級增強子（super-enhancers,SE）關閉。
消除 CKIα可誘導p53激活，CKIα的降解是來那度胺治療白血病前期骨髓發育異常症候群(pre-leukemic human myelodysplastic syndrome, MDS)的基礎。在這裡，我們描述了CKIα抑制劑的發展，它共同靶向轉錄激酶CDK7和CDK9，從而增強CKIα誘導的p53激活及其抗白血病活性。癌基因驅動的超級增強子(SE)對CDK7/9抑制高度敏感。我們在原代小鼠急性髓系白血病(AML)細胞中新鑑定了多個SE，並證明這些抑制劑可以抑制許多SE，並優先抑制SE驅動的癌基因的轉錄延伸。我們發現，阻斷CKIα與CDK7和/或CDK9協同穩定p53，阻止維持白血病細胞存活和增殖的 SE驅動的癌基因，並誘導細胞凋亡。這些抑制劑選擇性地消除白血病祖細胞，解釋了它們維持造血和治療白血病的效果；CKIα抑制劑可以根除MLL-AF9、TET2-/-Flt3ITD誘導的 AML小鼠模型和幾個患者來源的AML異種移植模型中白血病，說明它們在治療人類白血病方面有巨大潛力。
CKIα ablation induces p53 activation, and CKIα degradation underlies the therapeutic effect of lenalidomide in a pre-leukemia syndrome. Here we describe the development of CKIα inhibitors, which co-target the transcriptional kinases CDK7 and CDK9, thereby augmenting CKIα-induced p53 activation and its antileukemic activity. Oncogene-driving super-enhancers (SEs) are highly sensitive to CDK7/9 inhibition. We identified multiple newly gained SEs in primary mouse acute myeloid leukemia (AML) cells and demonstrate that the inhibitors abolish many SEs and preferentially suppress the transcription elongation of SE-driven oncogenes. We show that blocking CKIα together with CDK7 and/or CDK9 synergistically stabilize p53, deprive leukemia cells of survival and proliferation maintaining SE-driven oncogenes, and induce apoptosis. Leukemia progenitors are selectively eliminated by the inhibitors, explaining their therapeutic effificacy with preserved hematopoiesis and leukemia cure potential; they eradicate leukemia in MLL-AF9 and Tet2-/-;Flt3ITD AML mouse models and in several patient-derived AML xenograft models, supporting their potential effificacy in curing human leukemia.
圖1. 小分子CKI抑制劑的開發
(A)對CKIαflfl/flfl Mx1-Cre(CKIα KO)、CKIαfl/fl Mx1-Cre/p53KI/Ki(CKIα/p53，DKO)或CKIαfl/+Mx1-Cre(對照)的骨髓造血幹細胞群體進行流式細胞儀分析。LT-HSC，長期造血幹細胞；ST-HSC，短期造血幹細胞；MPP，多能祖細胞。Mann-Whitney檢驗進行統計分析，所有組的N=6。(B)選定的A系列CKI抑制劑的結構。(C)選定的A系列抑制劑與CKI(CSNK1)、CK2(CSNK2)和GSK3(GSK3)家族成員的結合常數(Kd)值用紅色表示，估算的Kd值(根據百分比控制[%Ctrl]計算)用黑色表示。(D)CKIα與A86絡合物的晶體結構。CKIα用卡通畫表示，A86用棒形表示(綠色、C和H原子；藍色、N原子；灰色、F原子)。插圖：ATP綁定口袋，顯示相互作用的殘基Leu93和Asp99與A86形成氫鍵(藍色虛線)。(E)用1 mM A51處理RKO細胞、CKIα敲減細胞(ShCKIα)或shCKIα對照細胞18小時，進行b-連環蛋白(b-Cat)磷酸化的蛋白印跡分析。在細胞收穫前4h加入蛋白酶體抑制劑(MG132，20 mM)。(F)用指示濃度的A系列抑制劑或二甲基亞碸(對照)處理18小時的RKO細胞的蛋白印跡分析。
圖2. CKI抑制劑的選擇性抗白血病活性
(A)取MLL-AF9-AML病鼠的原代BM細胞，用指定的抑制劑處理18小時，流式分析抑制劑對細胞的凋亡作用。(B)分別從WT或晚期MLL-AF9誘發的AML小鼠分離原代BM細胞，用DMSO或A51處理後進行集落形成單位(CFU)定量分析。(C)對用A51(10 mg/kg)或對照溶劑處理6小時的白血病小鼠BM細胞進行WB分析。(D) 用對照溶劑或單劑量A51(20 mg/kg)處理AML小鼠16小時。AML小鼠脾(上)、脛骨和股骨(下)的代表性圖像。(E)單劑量口服A51(20 mg/kg)或對照溶劑處理AML小鼠16小時，AML小鼠骨髓中GFP+白血病細胞的絕對數。(F和G)經A51(20 mg/kg)或對照溶劑單劑量處理16小時的AML小鼠，取有代表性的H&E染色組織切片和血塗片，觀察A51(20 mg/kg)或對照溶劑對AML小鼠的被感染(F)和未被感染(G)組織。另請參見圖S2。
圖3. CKI抑制劑對AML小鼠模型的長期療效
(A)口服(20 mg/kg)CKI抑制劑的CD-1小鼠的藥代動力學(PK)分析。(B)經A51(n=15)或對照溶劑(n=15)治療後，流式分析白血病的小鼠外周血中GFP+白血病細胞的百分比。A51治療(5 mg/kg/d)於白血病接種後第8天開始，每日1次，共3周(6天/周)。(C)在接種A14(N=10)或對照溶劑治療(N=8)小鼠後，隨著時間的推移，外周血中白細胞(WBC)的計數。A14治療(10 mg/kg/d)於白血病接種後第4天開始，每日1次，連續4周。(D)A51(5 mg/kg/d)或對照溶劑對AML小鼠Kaplan-Meier存活曲線的影響。統計學處理採用對數秩(MANTEL-COX)檢驗，p值<0.0001。(E)A14組(N=10)和對照溶劑組(N=8)小鼠的Kaplan-Meier生存曲線。A14治療(10 mg/kg/d)於白血病接種後第4天開始，每日1次，連續4周。統計學處理採用對數秩(MANTEL-COX)檢驗，p值<0.0001。(F)經A51處理的長期存活小鼠的代表性組織切片(與B、C實驗相同，於AML接種後5個月取材)。(G)經致死性照射的WT受體小鼠的Kaplan-Meier存活曲線，移植的BM來自A51治療的治癒供體小鼠(N=10個受體)或患病小鼠(N=8個受體)；供體BM細胞來自3隻A51治療的、治癒的(綠色)或患病(藍色)小鼠。(H)接受致死性照射的WT受體小鼠(N=10)移植A51治癒小鼠的骨髓，16周後流式檢測外周血中CD45.2+供者來源細胞的百分比。(I)從A51治癒的小鼠中分離出的BM移植到受體小鼠，移植16周後，受體小鼠外周血中GFP+白血病細胞百分比。
圖4. CKI抑制劑共同靶向CDK7和CDK9
(A)新型抑制劑CKIa-PHM，BTX161的結構。(B)用指定濃度的來那度胺、BTX161、A51或A86、DMSO處理MV4-11細胞6.5小時。(C)用A51(2 μM)、A86(2 μM)、BTX161(25 μM)或DMSO處理MV4-11細胞4小時，對MV4-11細胞MYC、MDM2、AXIN2和CCND1表達量進行qPCR分析。(D)A系列指定抑制劑的CDK7和CDK9KD值。(E)體外用A51、A86或A64或DMSO在一定濃度下作用原代AML脾細胞6小時後，WB分析。(F)用1 μM的A51、A86、A64或DMSO處理原代AML骨髓細胞4小時後，進行Myc、MDM2、MCL1和Axin2的qPCR分析。(G和H)用對照溶劑(Veh)或A51(20 mg/kg)分別處理原代AML脾細胞3小時和6小時(G)，或A86(10 mg/kg)處理5小時(H)，WB分析。(I)A86與P-TEFb的絡合物(CDK9-CycT1)的結構如圖所示，配體為棒狀(綠色，C和H原子；藍色，N原子；灰色，F原子)。插圖：ATP結合袋，顯示與A86相互作用的殘基Cys106和Asp109形成氫鍵(藍色虛線)。(J) A86(紅色，與CKIa結合；藍色，與CDK9結合)和CKIa(粉色)和CDK9(淺藍色)的重疊。另見圖S4。
圖5. 阻斷CDK7和AMP可幹擾白血病超級增強子（SE）並阻止SE驅動的白血病癌基因的轉錄延伸
(A)AML小鼠BM細胞中識別的增強子，按H3K27AC信號遞增排序(單位：rpm)。超級增強劑(SE)被定義為增強簇。不包括啟動子上的信號，簇排列在曲線拐點以上。明顯的增強信號用紅色表示。(B) CHIP-Seq定量分析A51(1 μm，4hr)與DMSO處理的AML細胞中所有SE的H3K27Ac信號的log2倍變化。(C)從WT分離的BM細胞、經DMSO或A51(1 μM)體外處理的AML小鼠的BM ，Chip-seq分析H3K27Ac信號的選擇位點的基因軌跡。紅線表示在DMSO處理的AML細胞中發現了SE。CDC16-Upf3a位點代表普通增強子。Y軸顯示ChIP-SEQ信號(rpm/bp)。X軸是基因組位置。(D) qPCR分析A51(1m)體外處理的原代AML細胞中相關基因的mRNA表達。(E)pSer2 CTD晶片序列分析：A51(1 μM，4小時)與DMSO處理的原代AML細胞中SE與普通增強子(TE)的序列分析。(F)DMSO或A51(1 μM，4小時)處理細胞中pSer2 CTD信號指定位點的單個基因軌跡(實驗與E相同)。Y軸顯示ChIP-SEQ信號(rpm/bp)。X軸表示基因組位置。
圖6. CKIa與CDK7和CDK9抑制劑聯合處理對p53的誘導和細胞凋亡有協同作用，並闡明了聯合處理引起的快速治療白血病的機制
(A)WB分析用BTX161(6小時)、iCDK9(4小時)或THZ1(4小時)處理MV4-11細胞後的相關蛋白變化。(B)A系列抑制劑對原代AML小鼠脾細胞的快速治療作用，先用特定濃度的抑制劑處理5min，然後洗掉抑制劑，再孵育6h(360min)。(C)以一定濃度A51短時間間隔處理RKO細胞，然後洗脫抑制劑，繼續孵育16小時。(D)A51對(B)處理的小鼠脾AML細胞的快速殺傷作用。流式細胞儀分析；圖表顯示Annexin-V陽性凋亡細胞的百分比。
圖7. A51在Tet2-/-;Flt3ITD和PDX小鼠中的長期治療作用
(A)經A51、米多妥林(MIDO)或DMSO(VEH)治療的Tet2-/-;Flt3ITD AML小鼠在處死當天的外周血白細胞計數。(B)每組有代表性的三隻小鼠的脾圖像。(C) 代表性小鼠骨髓和脾的H&E圖像。
(D) Tet2-/-;Flt3ITD AML小鼠骨髓中cKitHiCD11blow細胞的豐度。(E) Tet2-/-;Flt3ITD AML小鼠脾細胞的WB分析。在體外用A系列抑制劑A51、A86、A64和米多妥林或DMSO處理脾細胞5小時。(F) Tet2-/-;Flt3ITD AML小鼠來源的骨髓細胞的體外用A51、A86、A64和Mido處理，或用DMSO處理18小時，Annexin V+ cKitHi CD11b Low Tet2-/-百分比。 (G)A51、阿糖胞苷或對照劑治療5周期間外周血中hCD33+細胞的比例。(H)PDX-1小鼠治療5周後外周血白細胞計數。(I-K)PDX-2小鼠數據(核型正常，NPM1-，FlT3-ITD-，FlT3-TKD-)。處死時A51或DMSO處理組小鼠外周血中hCD33+細胞(I)和mCD45.1+(J)細胞的比率。(K)用A51或DMSO體外處理PDX-2小鼠骨髓細胞5小時後，進行WB分析。另見圖S6和圖S7。
在已鑑定的無數小分子CKI抑制劑中，沒有一種被證明具有有效阻斷CKIa活性的能力。該研究發現了一些可以同時靶向CKIα和轉錄激活酶CDK7和CDK9的小分子抑制劑，並闡明了其作用機制，通過增加p53穩定，促進凋亡和抑制SEs的轉錄延長等，在多種AML小鼠模型中展現了很好的治療效果，為AML的治療提供新方案。