老朋友的新篇章:二甲雙胍再戰抗腫瘤免疫

概述

二甲雙胍是1994年FDA批准的治療2型糖尿病（T2D）的一線口服藥物。在過去幾十年的臨床經驗中，它已被廣泛用於T2D患者，並被認為是一種安全且耐受性良好的藥物。有趣的是，一些針對T2D患者的病例對照研究顯示各種癌症類型的發病率降低，這提示二甲雙胍可能擁有降糖之外的抗腫瘤作用。事實上，相當多的研究報告了二甲雙胍可以通過不同的途徑對不同類型的癌症具有抗增殖作用。

最近在免疫腫瘤學領域的研究報告了二甲雙胍與免疫相關的全身效應。有趣的是，在相同的條件下，二甲雙胍在免疫正常小鼠模型中的抗腫瘤作用遠高於免疫缺陷小鼠模型，這意味著在生理和臨床條件下，二甲雙胍的作用主要是通過抗腫瘤免疫介導的。二甲雙胍的免疫調節活性在七十年前就被報導有抗病毒和抗瘧疾的作用。這得到了最近幾項發現的支持，包括二甲雙胍增加了CD8+T細胞活性。

由於T細胞是抗腫瘤免疫的主要效應器，T細胞活性一直是大多數FDA批准的腫瘤免疫療法的最終目標。然而，由於腫瘤的免疫微環境（TME）能有效地抑制TIL活性，目前的免疫療法在大多數實體瘤中的療效有限。在以往對糖尿病、心血管疾病和自身免疫性疾病的研究中，二甲雙胍通過影響炎症、缺氧、血管生成和T細胞活性，這些TME的主要成分，來改善每種疾病的預後。這些結果表明二甲雙胍的抗腫瘤作用可能是通過這些TME成分來實現的。因此二甲雙胍作為一種基於T細胞的腫瘤免疫治療的潛在佐劑值得進一步的研究。

腫瘤發生與抗腫瘤免疫

在腫瘤的發展過程中，癌細胞和我們的免疫系統進行了一場激烈的鬥爭，這場鬥爭主要發生在三個階段：起始、促進和進展。在起始階段，由多種致癌物質引起的基因組突變，可以激活癌基因並抑制腫瘤抑制基因。初始細胞通過關鍵突變的積累而轉化。當啟動的細胞暴露於生長因子時，細胞在促進階段積累了更多的突變，並具有高增殖性。然而，大多數轉化細胞都被固有免疫和適應性免疫清除。在固有免疫中，具有非經典主要組織相容性複合體（MHC）I異常表達的癌細胞被自然殺傷（NK）細胞識別，活化的NK細胞通過分泌細胞毒性穿孔素和顆粒酶溶解癌細胞。M1巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）被癌細胞分泌的炎性趨化因子募集。這些抗原提呈細胞（APCs）不僅通過吞噬作用吞噬癌細胞，而且通過向引流淋巴結中的T細胞遞呈腫瘤抗原來支持適應性免疫。最後，激活的CD8+細胞毒性T淋巴細胞（CTL）能特異性地清除癌細胞。

少數癌細胞經過反覆增殖和消除，導致它們長期存活而不形成腫瘤，但經過長期嚴格篩選的癌細胞獲得突變以逃避免疫監視。大多數存活的癌細胞下調經典MHC I水平和相關的抗原處理和呈遞機制（APM），從而阻止CD8+CTL的識別。另一方面，癌細胞增加非經典MHC I水平，以避免NK細胞的威脅。在經過所有這些之後，逃避免疫監視的癌細胞在進展階段形成腫瘤。

隨著腫瘤的生長，大多數實體瘤建立了由細胞和非細胞成分組成的TME，包括免疫細胞、成纖維細胞、血管、炎症信號、缺氧和缺糖。腫瘤的惡性程度與腫瘤細胞與TME的相互作用密切相關。特別是，促腫瘤的TME，如缺氧、慢性炎症和免疫抑制劑，例如，抑制性免疫檢查點、M2樣腫瘤相關巨噬細胞（TAM）、調節性T細胞（T regs）和髓源性抑制細胞（MDSCs），抑制T細胞監測並促進轉移。

二甲雙胍的抗腫瘤免疫作用

TME各成分之間存在著非常複雜的聯繫，TME抗腫瘤免疫功能的失調是由於不同階段多種免疫抑制作用的累積所致。因此，針對多靶點的綜合治療方法可以有效地提高腫瘤免疫治療的療效。以下是二甲雙胍靶向的TME成分。

二甲雙胍在慢性炎症中的作用

炎症就像癌症發展中的一把雙刃劍。作為固有免疫的一個組成部分，炎症在清除轉化細胞並隨後為適應性免疫呈遞癌症抗原方面起著重要作用。然而，已知慢性炎症會增加各種癌症的發病率和惡性程度。各種炎性細胞（例如巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞）的激活引起細胞因子風暴，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β和ROS。慢性暴露於這些炎症信號會增加TME中M2樣TAM的數量，不僅通過激活血管生成和上皮間充質轉換（EMT）誘導轉移，還抑制T細胞免疫。此外，慢性炎症可將骨髓髓樣前體細胞分化為MDSCs，MDSCs是一種主要類型的免疫抑制細胞，通過表達抑制檢查點和幹擾T細胞轉移到腫瘤中來消耗T細胞。

最近，二甲雙胍在幾種不同的疾病模型中都被證實具有抗炎作用。二甲雙胍可減輕多發性硬化症（一種中樞神經系統自身免疫性疾病）的誘導作用。在這項研究中，二甲雙胍通過下調趨化因子和促炎性細胞因子（如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-17）的水平來抑制單核細胞向中樞神經系統的浸潤。對T2D患者的對照病例研究表明，二甲雙胍可減少心血管併發症，相關機制研究表明，二甲雙胍通過AMPK途徑使NF-kB信號失活，從而降低炎症細胞因子水平，包括TNF-α和IL-6。此外，二甲雙胍還通過抑制線粒體複合物I抑制LPS激活的巨噬細胞產生ROS和IL-1β。總的來說，二甲雙胍具有減輕腫瘤前炎症的有益作用，有望預防腫瘤惡性腫瘤和TME中的T細胞衰竭。

二甲雙胍對腫瘤內缺氧的影響

缺氧是一種重要的惡性TME成分。隨著腫瘤的生長，癌細胞迅速消耗氧氣。導致腫瘤缺氧。癌細胞顯著地改變了它們的基因圖譜，以克服惡劣的條件並保持增殖。缺氧誘導因子（HIF-1）是激活參與葡萄糖吸收、糖酵解和血管生成相關基因的主要轉錄因子。缺氧和HIF信號也通過增加EMT相關基因的表達和通過血管生成增加癌細胞的擴散來誘導轉移。此外，缺氧和HIF信號有助於癌細胞逃避免疫監視，缺氧可通過抑制DC激活T細胞的刺激能力來幹擾適應性免疫。缺氧還通過降低增殖和活力來限制TIL的數量。缺氧持續增加PD-L1的水平，PD-L1是一種主要的抑制性免疫檢查點分子，可誘導TME的T細胞衰竭。

最近的一項研究報告了二甲雙胍的抗缺氧作用。在這項研究中，二甲雙胍治療減少了缺氧的陽性區域，同時HIF-1α和促血管生成因子水平降低。二甲雙胍通過缺氧抑制肝細胞癌和口腔鱗狀細胞癌中HIF-1α的積聚。重要的是，Scharping等人報導二甲雙胍可通過降低氧耗來緩解腫瘤內缺氧，從而提高TME的T細胞免疫功能。因此，二甲雙胍與靶向PD-1的ICB具有顯著的協同抗腫瘤作用。這些證據表明，二甲雙胍治療可以通過減輕腫瘤內缺氧而提高T細胞免疫功能。

二甲雙胍對PD-L1表達的影響

程序性死亡配體1（PD-L1）是一種主要的免疫檢查點分子，對T細胞活性有負性調節作用。在各種癌症類型中，如腎細胞癌（RCC）、乳腺癌、結直腸癌、胃癌、非小細胞肺癌（NSCLC）、甲狀腺乳頭狀癌和睪丸癌，PD-L1的高水平表達與預後不良有關。PD-L1與PD-1受體的結合抑制T細胞受體（TCR）信號級聯反應，並抑制CTL的活性。因此，有人積極嘗試通過阻斷PD-L1/PD-1信號來恢復CTL活性。

最近，研究報導了二甲雙胍激活的AMPK直接在PD-L1的195絲氨酸處磷酸化，導致PD-L1的異常糖基化。最終，異常的PD-L1通過內質網相關蛋白降解（ERAD）途徑降解，恢復CD8+CTL活性。此外，二甲雙胍通過降低IFN-γ治療增加的膜結合PD-L1水平來改善CD8+T細胞的細胞毒性；聚ADP核糖聚合酶抑制劑（PARPi）耐藥細胞上調PD-L1表達，二甲雙胍處理後逆轉PD-L1水平，使PARPi耐藥細胞對CTL敏感。這些研究都表明二甲雙胍可以通過降低TME中PD-L1水平來提高T細胞免疫功能。

二甲雙胍對T細胞代謝重編程的影響

在適應性免疫中，受引流淋巴結吞噬性APCs誘導的效應CD8+CTL可以特異性識別和殺傷腫瘤細胞。然而，它們的衰竭會導致失能和細胞凋亡。癌細胞依賴於低效的有氧糖酵解作為ATP的主要來源，而不是氧化磷酸化，並通過積極吸收葡萄糖來滿足需要。一種被稱為「沃堡效應」的不尋常的代謝特性對癌細胞在缺氧條件下的存活具有優勢。有趣的是，效應CTL的代謝在與腫瘤中的癌症抗原結合後轉化為有氧糖酵解。這種代謝相似性鼓勵癌細胞和CTL之間的糖攝取競爭，導致效應劑CD8+CTL的代謝衰竭。因此，衰竭T細胞的代謝重編程可以作為提高抗腫瘤免疫的治療靶點。

由於二甲雙胍的下遊因子AMPK和mTOR是能量敏感和線粒體功能的主要調節因子，二甲雙胍可能對衰竭T細胞的代謝重編程起作用。事實上，二甲雙胍治療已經被證明可以增加腫瘤中CD8+CTL的數量並防止其衰竭。據報導，AMPK在葡萄糖缺乏時通過激活氧化代謝來維持CTL的一致活性，在體外激活和體內腫瘤發展過程中，對T細胞中的AMPKα1進行基因敲除可導致CD8+CTL凋亡，並在免疫能力強的小鼠模型中促進腫瘤生長。

大多數完成任務的CD8+T細胞通過凋亡的方式被移除，其中一些細胞分化成CD8+記憶T細胞，它們對同一個敵人反應更快、更有效，防止復發。這種向CD8+記憶性T細胞的轉變也需要代謝重編程。有趣的是，Elikawa等人表明二甲雙胍不僅能增強CD8+CTL的多功能性，而且能提高長期記憶免疫功能。在本研究中，二甲雙胍治療可提高效應記憶T細胞/中樞記憶T細胞（TEM/TCM）比值。總的來說，二甲雙胍可能通過AMPK/mTOR途徑的代謝重編程來提高CTL的抗腫瘤效能和體內持久性。

二甲雙胍對腸道菌群的影響

腸道微生物群異常在許多與免疫紊亂相關的疾病中出現，如炎症性腸病、類風溼性關節炎、心肌代謝疾病、中樞神經系統自身免疫性疾病和癌症。通過這種微生物免疫系統的直接調節可以改善我們的免疫系統。有研究表明腸道菌群可能是二甲雙胍的重要介質，對腫瘤免疫有積極影響。

最近，三個不同的小組在相似的時間報告說，在ICB應答者和非應答者之間觀察到了不同的腸道微生物群特徵，腸道菌群對ICB的治療效果有很大影響，糞便微生物移植（FMT）模型顯示IBC應答者移植的ICB療效遠高於無應答者，ICB應答者的FMT顯著提高了T細胞免疫功能。此外，對ICB免疫治療有益的微生物被鑑定為（1）prausnitzii糞桿菌，（2）長雙歧桿菌，（3）粘液阿克曼菌。

Cuesta Zuluaga等人證明了T2D、二甲雙胍和腸道菌群的相關性。有趣的是，二甲雙胍改變了T2D患者的腸道菌群，尤其是增加了嗜粘多菌和幾種雙歧桿菌。如前所述，粘粘桿菌和雙歧桿菌是被鑑定為有益於ICB免疫治療的微生物種類。此外，已知嗜粘桿菌和雙歧桿菌能產生短鏈脂肪酸（SCFA），如醋酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，它們具有免疫調節和抗炎作用。這些證據有力地支持二甲雙胍可以通過腸道菌群系統地影響抗腫瘤免疫。然而，二甲雙胍如何改變腸道菌群以利於抗腫瘤免疫，以及二甲雙胍增加細菌種類與抗腫瘤免疫之間的聯繫在很大程度上還不清楚。

小結

目前的腫瘤免疫治療大多以TIL為靶點，通過維持TIL在TME中的活性來發揮作用。為了確保其有效性，必須充分實現抗腫瘤免疫過程，包括APCs浸潤、癌抗原呈遞、T細胞啟動和TIL活性維持。事實上，達到這些先決條件的「熱」腫瘤對癌症免疫治療反應良好，但不滿足這些先決條件的「冷」腫瘤對免疫治療的反應較差。如果冷腫瘤能轉化為熱腫瘤，將大大提高目前腫瘤免疫治療的療效，擴大受益人群。

在這種有利的轉化過程中，問題在於冷腫瘤中的免疫抑制的TME在抗腫瘤免疫的不同階段抑制多個靶點。因此，很難期望通過單因素或路徑調整方法進行有效的轉換。雖然抑制劑雞尾酒的選擇可以考慮針對多種免疫抑制因子，但它可能會導致過度的副作用，如累積毒性。為了支持冷腫瘤的轉化，重新定位先前耐受良好、具有多重免疫調節作用的藥物將是一種更有效、更安全的方法。

二甲雙胍的安全性和耐受性已經被幾十年的臨床經驗所證明。此外，該藥物對抗腫瘤免疫有多種有益作用，例如具有抗炎和抗缺氧作用，增加T細胞活性，並對腸道微生物群產生有利作用。此外，對照病例研究表明，二甲雙胍可降低各類癌症的發生率，並通過多種動物模型觀察到二甲雙胍對抗腫瘤免疫的積極作用。這些發現有力地表明，二甲雙胍有很高的潛力成為一種佐劑，通過支持冷腫瘤的穩定轉化，全面壓倒免疫抑制性TMEs。已經有二甲雙胍和ICB聯合治療的臨床研究在開展中，期待老朋友的重新評價，在新的戰場給我們帶來驚喜。

參考文獻：

1.A new aspect of an old friend: the beneficial effect of metformin on anti-tumor immunity. BMB Rep. 2020 Nov;53(10):512-520.