Cell:深刻反思腸道菌群與人類疾病研究,是時候將微生物組研究拉回...

撰文 | 珊今

責編 | 兮

2020年1月23日，加拿大University of Alberta的Jens Walter在Cell發表觀點文章Establishing or Exaggerating Causality for the Gut Microbiome: Lessons from Human-Microbiota-Associated Rodents，對腸道菌群研究進行了反思。現BioArt將文章編譯如下，以供讀者思考。

摘要

現今對於腸道菌群的研究可謂如火如荼，越來越多的人類疾病被認為與自身腸道微生物的改變有著千絲萬縷的聯繫，但是，這種改變與發生的疾病之間是因果還是伴隨或者乾脆就不相關，在很大程度上尚待解決。在之前的研究中，人們試圖用人類微生物群相關（Human-microbiota-associated，HMA）齧齒動物中得到的數據來解釋宿主病理和微生物種群改變之間的關係。在系統的綜述中，我們發現95％的已發表的有關HMA嚙齒類動物的研究（36/38）報告了病理表型轉移至受體動物的行為，並且許多研究結果就此推斷出了對人類疾病與微生物群組改變的因果推論。我們認為這種跨物種的推論是令人難以信服的，並且誇大了腸道微生物組在人類疾病中的作用。在這裡我們主張採用更嚴謹和批判的方法來推斷因果關係，以避免錯誤的概念並防止不切實際的期望，這些期望可能會破壞微生物組科學的信譽並延遲其轉化。

微生物組學研究現狀

在過去的十年中，有關微生物組的文章迅速增加，僅在2018年就出現了超過一萬篇。這些文章將微生物組與各種人類慢性疾病聯繫，這樣微生物組學研究就具有了重大的治療意義，這引起了科學家的濃厚興趣。實驗動物模型為微生物組在慢性疾病狀態中的作用提供了有力的經驗證據。但是，這樣的因果推論在人類中卻比較困難。在某些方面，許多人類疾病與自身糞便微生物群有關，患病個體微生物群在某些方面與健康個體不同，包括分類學成分、多樣性指數和/或功能值/豐度的變化。這種與疾病相關的微生物組變化通常被稱為「腸道菌群失調」，這個術語在微生物組領域廣泛使用，但定義仍然模糊不清，經常被濫用。由於尚未定義「正常」或「健康」的微生物組，因此我們使用術語「腸道菌群失調」僅指與特定疾病或狀況相關的微生物組相較於對照發生了變化。在大多數情況下，這種「腸道菌群失調」微生物組是疾病的原因還是後果，還是兩者都是由第三因素引起的，都未經證實。如果微生物組要成為幹預的有效靶點，則必須進行確認。

建立因果關係的挑戰對科學或醫學而言並非新鮮事物。將流行病學觀察結果從相關性轉變為因果關係具有眾所周知的局限性，因此在沒有對相關疾病機制性洞察的情況下警惕相關性至關重要。在微生物組領域，有兩種文獻記載，清楚的將微生物標誌物與疾病的病因聯繫起來的案例：幽門螺桿菌相關的消化性潰瘍和胃癌和梭狀芽胞桿菌（或梭狀芽胞桿菌）難治性感染相關的腹瀉。然而，複雜的微生物組與其他炎性、代謝性、腫瘤性和神經行為性疾病之間的因果推論既沒有說服力也沒有結論性。此外，由於微生物群是高度個體化的細菌、古細菌、真菌、病毒和原生動物組成的群落，因此鑑定導致病理的複雜微生物群的病因成分變得很複雜，所有這些微生物群及其代謝物都可能在疾病中起作用，或者單獨或一起發揮作用。此外，某些微生物組成分可能會保護或減輕疾病，但是它們的影響可能只是個例，可能不是直接發生的，它們更可能使宿主容易患病。因此，因果關係很少是簡單的，而是相當複雜的，多維的，並且是由微生物群落內部的協同相互作用驅動的。

有沒有什麼有力的實驗證據能證明腸道菌群的作用呢？有，腸道菌群移植（FMT）的相關實驗可以獲得腸道微生物群在人類疾病中起因作用的最具說服力的實驗證據。微生物組預防艱難梭菌相關疾病儘管是出色的實驗範例，但人類FMT仍然有局限性。首先，出於道德原因，它們只能用於研究微生物組的保護特性。其次，FMT可能無法糾正已經改變的微生物組，特別是在微生物組未受到嚴重破壞的疾病中。最後，由於需要長期的前瞻性研究，腸道菌群在人類慢性疾病發展中扮演什麼角色用FMT來評估也是不切實際的。因此，需要間接的實驗模型來建立改變的微生物組與疾病發病機制之間的因果關係。進行這種因果推斷的最常用模型是將糞便微生物群落從有或沒有疾病或病症的個體移植到無菌的齧齒動物中，然後對受者動物的病理表型進行比較分析。這種模型被稱為人類微生物群相關（HMA）齧齒動物。在這裡，我們認為使用HMA嚙齒類動物提出的因果關係主張的研究比例過高，這是不可信的，並且可能是由於實驗設計不夠嚴格，統計分析不適當以及偏見所致。誇大微生物組在疾病中的作用會損害微生物組科學的信譽，並可能延遲其轉化。我們嘗試將批評轉化為建設性的建議和實驗指南，以評估動物模型中的因果關係，並提出替代方法檢驗因果關係。我們提倡改變微生物組科學的思維方式，

即研究應該以其科學的嚴謹性（即使是陰性的結果）為根據進行評估和發表，而不是一味博人眼球，追求轟動效應。

HMA鼠模型：優點突出，缺點明顯

HMA鼠模型用於回答各種科學問題。首先，它們可以確定人類微生物群是否可以在齧齒動物疾病模型中誘發病症並建立潛在機制，以及表型是否受到環境因素（例如飲食）的影響。其次，它們可用於建立改變的微生物組與人類宿主的疾病或其他病理或生理狀況之間的因果關係。後一種應用是最常用的，已應用於多種病理生理狀態，例如肥胖症哮喘、過敏症、炎症性腸病（IBD）、結直腸癌、帕金森氏病、抑鬱症、營養不良和自閉症。此外，HMA鼠模型代表了一個平臺，可以使用集成的「組學」方法來識別導致疾病的致病微生物以及引起疾病的機制變化的微生物組的因果成分。

儘管在確立微生物組改變與人類自身疾病的因果關係中HMA鼠是金標準和基石，它們在此應用中還是存在著明顯的局限性。有一個無法迴避的問題就是人類腸道微生物組的很大一部分類群無法在受體動物中定殖；能夠定殖的類群也會形成區別於人類供體的群落。最重要的是，移植後的HMA鼠並沒有導致人生病的生態因素（例如飲食，生活方式，疾病表型和人類基因型），使得與疾病相關的改變難以重現。而且定殖過後的類群可能不參與它們與原生宿主建立的宿主微生物相互作用。例如，HMA小鼠在免疫，腸道和大腦成熟方面存在缺陷，並且與宿主的代謝相互關係也有所不同。細菌致病性研究證明了跨越宿主物種的困難。幽門螺桿菌和艱難梭菌是人類微生物組中在人類疾病中已建立因果關係的兩個成員，它們中的兩個均未表現出足夠的定殖性以引起常規鼠模型的發病。這樣的例子還有很多，空腸彎曲桿菌，傷寒沙門氏菌，傷寒沙門氏菌，霍亂弧菌，志賀氏菌和蒼白密螺旋體等人類病原體均無法在小鼠中很好地定殖或復現人樣疾病。綜上所述，雖然HMA小鼠模型在概念上對疾病因果的研究很有吸引力，但單一人類致病微生物無法在小鼠身上複製其病狀也缺乏相應的環境限制，這讓人懷疑整個微生物群是否能做到這一點。

HMA小鼠模型的實驗設計

HMA 齧齒動物模型始終有效！那陰性結果去哪兒了？

通過系統性的文獻綜述，我們評估了建立或暗示HMA鼠模型與改變的人類微生物群與疾病或病理狀況之間因果關係研究的「成功」率。在38項符合納入標準的研究中，除兩項（36/38；95％）外，所有研究均得出結論，與健康供體相比，出現類似於人患病症狀的患病供體糞便移植到無菌小鼠後會導致更嚴重的疾病。剩下的兩個例外都研究了人類微生物組在大腸癌中的致病性，得出的結論是，受體小鼠的疾病與供體的疾病狀態無關，而是取決於小鼠模型的基線微生物組或人類結腸黏膜的微生物組成。

值得注意的是，系統評價中的研究涵蓋了廣泛的致病過程：炎性、過敏、腫瘤、退化、代謝、和由遺傳和環境等多因素引起進行性慢性疾病。考慮到這種複雜性以及人類微生物群中大多數報導的「不良生物模式」並非特定於某種疾病狀態的事實，因此微生物組的改變很可能是繼發於疾病，因此微生物組的因果主張似乎在所有疾病狀態下不可信。這促使人們質疑HMA鼠模型中類人疾病的科學標準是否足夠嚴格。

在這些研究中只有少數研究（34％；13/38）確定了潛在的將不良微生物組與疾病聯繫起來的機制。舉個例子說，在定殖有對牛奶過敏的嬰兒的微生物群的無菌小鼠迴腸中，基因Fbp1、Tgfbr3和Ror2被下調。而帶有厭食桿菌的無菌小鼠的單菌落上調了這些基因，並且保護了小鼠免於過敏反應。這樣的研究儘管有時候超出了研究者的可用資源範圍，但是仍然值得花力氣去做，因為這對於微生物組學領域的發展至關重要。

HMA齧齒動物是一個相對較新的模型，並且實驗設計尚未標準化。通常，每個人類疾病和對照組使用少量（1-5）人供體，然後將這些「供體微生物組」複製到大量單獨的小鼠中，然後將其用於統計推斷。這樣的實驗設計和分析由於幾個原因而令人懷疑。首先，大多數研究中使用的少量捐贈者並未捕獲到人類腸道微生物組的廣泛個體間差異，該差異通常遠大於疾病引起的效應量。這種變化的很大一部分（> 80％）不能歸因於已知因素，其中很大一部分可能是由隨機的生態過程引起的。因此，即使微生物組差異是造成人類疾病的原因，樣本量太少也不足以讓我們下結論。大多數已發表的有關HMA嚙齒類動物的研究缺乏嚴格的實驗設計和統計分析，因為它們使用的供體數量不足並且遭受「無法重複複製」。值得注意的是，令人鼓舞的是，最近的一些研究使用HMA齧齒動物已應用了適當的統計數據。

儘管實驗設計和統計分析中的缺陷都有可能導致我們的系統評價中陽性研究的代表性偏高，但實際上對陽性結果的貢獻卻沒有那麼明顯，有別的因素對此貢獻卻更大。偏見出現在各個層面，但是最大的因素是，要使研究在主要期刊上發表，結果必須是正面的，負面的發現很少在這些期刊上發表。這一點可能是幾乎所有科研工作者心中的痛。當幾乎所有報告都是正面的時候，產生的懷疑就會越大，而審查的理由就越合理。為什麼這很重要？自我校正可能是科學上最強大的方面，但是只有在發表負面發現時它才能起作用。微生物組科學的臨床轉化需要確認宿主與微生物之間的因果關係以及確定其貢獻機制。具體來說，是對改變的微生物群的校正。通過FMT，僅當微生物組學變化是疾病的因果、起因時，活生物療法或微生物產品才是有益的。

確定腸道微生物組在疾病病因學中的因果作用的其他實驗方法

測試因果關係時如何提高實驗嚴謹性？

HMA齧齒動物是研究因果關係和宿主-微生物相互作用機制的有力模型，我們在這裡並不反對它們的使用。它們特別適合研究代謝宿主-微生物組的相互作用，但是為了測試與人類疾病相關的微生物組變化的因果作用，HMA動物實驗設計必須可靠。我們已經擴展了先前的建議，即如何設計，分析和解釋HMA模型，並在方框中總結了我們的建議。方法和標準可能會繼續發展，我們鼓勵其他人提出替代方案、或其他指南和策略來改善這些概述的建議，這些建議將作為討論如何評估微生物群落因果關係的起點。該領域將從專家協會的指南中受益，該指南定義了使用HMA動物進行實驗所需的最少信息。這一領域也需要足夠的經費去做一些關鍵性實驗。

接受在齧齒動物身上實驗作為在人類疾病中起作用的證據的標準需要更嚴格、精確的審查，並且最好與可能的分子機制相關。鑑於因果推理和機制的重要性，推動HMA研究標準的改進可能有助於解決已為微生物組領域確定的問題，如「陽性結果研究」偏好、炒作、缺乏審查、術語、定義等。改善HMA模型的其他策略也值得考慮。鑑於齧齒動物和人類的相似性有限，通過免疫或代謝方式「人源化」（例如，通過植入人類免疫或代謝細胞）的齧齒動物將增加檢測特定於人類的宿主微生物相互作用的可能性。另外，像豬和靈長類這樣的更能模仿人類生理的實驗宿主，假如成本下降的話也會成為很好的實驗模型。為了建立測試人類微生物組研究中因果關係的框架，人們對科赫的假設進行了修訂，並提出了實驗程序以驗證從微生物組的基因組分析中得出的假設。這些框架利用了在確定因果關係方面的最新突破，即通過利用多組學數據集的研究方法進行研究。儘管這些模型功能強大，但它們也遭受了HMA齧齒動物的某些相同限制，但如果在更合適的接收宿主中使用，則這些偏移可能會抵消。

鑑於從動物推斷人類發現的局限性，已經出現了直接在人類中建立因果關係的方法。孟德爾隨機化和中介分析等新穎的統計方法已被用於人類研究中腸道微生物組代謝物與宿主標誌物之間的因果推斷，以及數學和機器微生物組數據可採用因果分子網絡，結構方程模型或貝葉斯網絡推斷等學習方法。諸如幹預分析之類的策略受益於縱向數據，在縱向數據中，變量的時間順序可以幫助解開因果關係，因為這種影響不能在時間上先於原因。然而，這些方法所需要的統計假設是否能夠對微生物群落做出可靠的因果推斷，必須首先建立和驗證。

改變觀念和政策

微生物組科學顯然會從更加嚴格和更多批判中受益，但是與所有科學一樣，在其他方面也需要改變才能實現其光明前景。早就應該改變對科學研究價值和標準的激勵機制和判斷標準。人們已經提出了與科學所有領域相關糾正措施的詳細清單，但是由於發表偏見導致的誇大其詞似乎在微生物組在人類疾病中的因果作用研究中更成問題。一些科學雜誌已經發布了一些「負面問題」，但更可取的是將態度轉變為根據其科學優點而不是缺乏轟動效應來判斷負面發現。半個多世紀前，卡爾·波普爾（Karl Popper）建議嚴謹的研究應該嘗試拒絕它的假設；「對理論的每一次真正的檢驗都是一次嘗試證偽它，或反駁它」。可悲的是,大多數研究人員、微生物組領域的評論家以及幾乎所有的高影響因子期刊編輯，似乎認為接受零假設是失敗的一件事。正如所有的科學努力一樣，我們的領域如果更高層次期刊的編輯政策更好以及資助機構的指導方針不去鼓勵任何針對陰性數據、重複、實驗驗證設計和統計分析的歧視，那我們領域發展的春天才會來臨。由於科研人員在這些期刊上的成功在很大程度上決定了他們的科學生涯和研究經費，因此期刊政策的變化可能具有變革性的意義。

結論

鐘擺向兩個方向擺動。曾經有一段時間，知識界不太接受幽門螺旋桿菌是導致人類各種複雜疾病的原因。但是現在，似乎有人一廂情願地認為，無論病因多麼複雜，大多數疾病和病理過程都與微生物組有關。是時候將微生物組研究拉回正軌了，我們要回歸到更批判性和更嚴謹的科學方法上，特別是當使用HMA齧齒動物作為其建立因果關係的基礎模型時更應該注意這一點。這麼做無疑將會讓這一激動人心的領域在人類健康方面應用的光明前景得到保障。

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.12.025