來源：來源網絡 2006-12-14 21:32
1．螢光染料
螢光基團通常各自擁有單一的光吸收峰。在光的刺激下，螢光基團吸收光的能量後通常以三種方式釋放出能量：
1) 光能 許多螢光基團吸收光能後仍舊以光能形式釋放能量，並且發射光的峰值大於吸收峰。比如螢光染料Fam的光吸收峰為490nm，而發射峰為530nm。
2) 熱能 某些螢光基團吸收光能後，能量轉換為熱量擴散到環境中，如Dabcyl。
3) 轉移給臨近的分子 當臨近的分子滿足發生能量轉移的要求時，能量從螢光基團傳遞到臨近的分子。
2．螢光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）
當某個螢光基團的發射譜與另一螢光基團的吸收光譜發生重疊，且兩個基團距離足夠近時，能量可以從短波長（高能量）的螢光基團傳遞到長波長（低能量）的螢光基團，這個過程稱為螢光共振能量轉移(FRET),實際相當於將短波長螢光基團釋放的螢光屏蔽。
3．螢光PCR
螢光PCR不同於其他PCR的地方在於PCR過程中利用螢光染料在光刺激下釋放的螢光能量的變化直接反映出PCR擴增產物量的變化，螢光信號變量與擴增產物變量成正比，並通過足夠靈敏的自動化儀器實現對螢光的採集和分析以達到對原始模板量定量的目的。主要有以下幾類：
1) 螢光染料直接結合擴增產物 如SYBB Green I,類似於EB,能特異性地區分單雙鏈DNA,只與雙鏈DNA結合.
2) 螢光標記引物 對引物進行螢光標記從而使螢光標記基團直接摻入PCR擴增產物.
3) 螢光標記探針 常規引物以外，引入螢光基團標記的特異性探針，探針可與模板發生一對一結合關係。
a) Taqman雙標記探針（TaqmanTM 5-nuclease assay）
b) 分子信標探針（Molecular beacon TM）
c) LightCycler TM雜交雙探針
螢光標記探針的最大優點在於其特異性非常強，避免了非特異性擴增造成的假陽性信號。 匹基生物開發的螢光PCR檢測試劑盒主要基於Taqman技術 (TaqmanTM 5-nuclease assay)：除常規的一對引物以外，PCR反應體系中另加有一個能與PCR產物雜交的螢光雙標記探針。該探針的5端標記一個螢光基團，3標記另一個螢光基團。此時5端螢光基團吸收能量後將能量轉移給臨近的3』端螢光淬滅基團（發生FRET），因此正常情況下檢測不到該探針5端螢光基團發出的螢光信號.但當溶液中有模板時，模板變性後低溫退火時，引物與探針同時與模板結合。在引物的介導下，沿模板向前延伸至探針結合處，發生鏈的置換: Taq酶的5—3』外切酶活性將探針5端連接的螢光基團從探針上切割下來，游離於反應體系中，從而脫離3』端螢光淬滅基團的屏蔽，接受光刺激發出螢光，切割的螢光基團數與PCR產物的數量成比例。因此根據PCR反應液的螢光強度即可計算出初始模板的數量
4．螢光定量PCR（Fluorenscent Quantitative PCR,FQ-PCR）
1) Threshold：PCR擴增信號進入相對穩定對數增長的最下限，通常設定在S型擴增曲線的增長拐點處附近。
2) Threshold Cycle (TC or CT) OR Cross Point(CP)：PCR增長信號與Threshold發生交匯的循環數，也是FQ-PCR判斷陰陽性和進行定量分析的依據。
3) Standard Curve(標準曲線)：CT/TC/CP與起始模板量的對數呈反比關係：Y=-aX+b
其中X=Log Concentration
Y=CT/TC/CP
PCR擴增過程中，引入一系列已知起始濃度的模板與未知樣品同時進行擴增，利用該系列模板的CT/TC/CP值與已知濃度對數做直線回歸得到標準曲線，從而計算出未知樣品的起始模板濃度。
5．螢光PCR的優點
螢光PCR區別於其他PCR方法主要有以下優點：
1) 全封閉反應，無需PCR後處理
2) 特異性強，靈敏度高
3) 採用對數期分析，摒棄終點數據，定量準確
4) 定量範圍寬，可達到10個數量級
5) 儀器在線式實時監測，結果直觀，避免人為判斷
6) 可實現一管雙檢或多檢
7) 操作安全，縮短時間，提高效率
8) 利於自動化和聯網管理
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