普渡大學團隊:NgAgo有基因編輯能力 韓春雨事件迎最新進展

　　2019 年 4 月 4 日，預印本網站 BioRxiv 刊登了一篇來自美國普渡大學團隊的文章（未經過同行評議）。這篇名為「NgAgo-enhanced homologous recombination in E. coli is mediated by DNA 1 endonuclease activity」的文章，主要闡述了 NgAgo 核酸內切酶活性介導增強大腸桿菌的同源重組，即NgAgo 具備內切DNA 的能力（區別於從線性的DNA分子兩端的外切）。

　　而 NgAgo，正是韓春雨論文造假事件中的核心蛋白因子。NgAgo 是否可以作為一種 DNA 引導的核酸內切酶在真核生物內靶向性切割 DNA，也是在韓春雨論文造假事件中的最關鍵問題之一。

　　圖丨普渡大學論文（來源：BioRxiv）

　　NgAgo 走進公眾視野是在 2016 年。當時，韓春雨領銜的 NgAgo研究既在中國開啟了一輪「造星運動」，也引發了後續強烈反彈的關注和論文造假風波。2016 年 5 月 2 日，河北科技大學韓春雨作為通訊作者在國際著名學術雜誌Nature Biotechnology發表了題為「DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute」的研究論文。這一論文主要描述了 NgAgo 可進行 DNA 引導的基因組編輯並闡明了其中的原理，該發現當時被喻為CRISPR-Cas9 基因編輯技術後又一「強大」基因編輯「利器」。

　　圖 | 河北科技大學副教授韓春雨

　　2016 年 7 月 29 日，澳大利亞科學家 Gaetan Burgio 發表長文，表示不能重複韓春雨論文中的一些結果；國際轉基因技術協會則給會員群發郵件，告誡大家「NgAgo 無法在哺乳動物細胞中進行基因編輯，不要再浪費時間、金錢、人力和課題」。這一新的發展隨後被國內多家媒體報導，NgAgo 爭議由學術界的國際化、專項社會關注的大眾化、白熱化。

　　到了 2016 年 8 月 2 日，Nature Biotechnology首次對爭議表態，「已有若干研究者聯繫本刊，表示無法重複這項研究。本刊將按照既定流程來調查此事。」8 月 8 日，Nature雜誌則爭議做了專題新聞報導，稱有不願透露姓名的科學家向Nature記者證實實驗的可重複性。河北科技大學則表示，在一個月之內韓春雨將採取適當形式公開驗證，屆時將有權威第三方作證。8 月 9 日，韓春雨應公益組織 Addgene 要求，發布新版的 protocol。直到 2017 年 8 月 3 日，Nature Biotechnology發布聲明，撤回韓春雨團隊 2016 年 5 月 2 日發表在該期刊的論文。該風波隨著撤稿公告的公示告一段落。

　　圖丨NgAgo 三維重建（NgAgo-enhanced homologous recombination in E. coli is mediated by DNA 1 endonuclease activity）

　　那麼，普渡大學這次最新的研究，是否能夠解答此前人們對 NgAgo 的疑問呢？

　　在了解 NgAgo 前，我們來認識一下 pAgo。pAgo，即原核生物 Argonautes，其與已成熟的 CRISPR-Cas 基因編輯系統相似，也是通過與導向單鏈核酸相結合，進而對其導向鏈識別的靶向鏈進行切割，完成對目標 DNA 的編輯工作。

　　但與 CRISPR-Cas 基因編輯不同的是，pAgo 並不需要一個額外的與靶基因相鄰的前間隔序列鄰近基序( protospacer adjacent motif, PAM )的短片段DNA

　　，這在理論上可以對任意序列進行DNA 編輯工作而不再受到需要PAM存在的限制了。也是由於其具有強大的DNA 編輯潛力，因此被研究人員譽為基因編輯的「萬能鑰匙」。不過，由於研究深入程度和技術等原因，pAgo 一直沒有開發出像 CRISPR-Cas 這樣既簡潔又富有功能性的準商業化產品。

　　NgAgo 作為 pAgo 的候選者，近年來才被逐漸發現並提純，但此前的研究並沒有讓各國科學家們意識到它具有DNA 核酸內切酶的作用。這一分子來源於嗜鹽古菌這一古老的原核生物，在其胞內表達較低，但在非嗜宿主體內重摺疊後也不具備 DNA 編輯功能。

　　先前的研究也證實重摺疊後的 NgAgo 並不能在體外完成 DNA 編輯工作，不過可以在 37℃環境中的菌體內具備基因組編輯的功能。而在普渡大學這次的研究卻顯示，NgAgo 確實具有 DNA 內切作用。

　　圖丨NgAgo 胺基酸序列分析（NgAgo-enhanced homologous recombination in E. coli is mediated by DNA 1 endonuclease activity）

　　普渡大學整個實驗的思路是這樣的，首先是對 NgAgo 提純。在這個環節，團隊將 NgAgo 基因與 GST 和 His 標籤重建載體，轉化菌體後 22 °C培養，使用 IPTG 誘導，發現表達的 NgAgo 呈現可溶和包涵體混合表達情況，分別利用 Ni 柱和穀胱甘肽瓊脂糖柱層析純化，得到可溶和重新摺疊的純化的 NgAgo 分子。同時根據胺基酸序列再用計算機進行了分子三維重建。結果顯示，NgAgo 具有常規的 N-末端以及 PIWI、MID 和 PAZ 結構域，同時還具有潛在的單鏈 DNA 結合（repA）結構域。

　　隨後，研究者對純化後的 NgAgo 進行了體外活性及其功能檢測。他們發現，可溶性且非在摺疊結構的 NgAgo 分子在體外具有隨機 DNA 切割功能。

　　圖丨NgAgo 的 repA 和 PIWI 兩個輔助結構域（NgAgo-enhanced homologous recombination in E. coli is mediated by DNA 1 endonuclease activity）

　　具體而言，究竟這一分子各個結構域都具有什麼不同的功能？

　　研究者首先利用 repA 敲除體和 repA 突變體分析了 repA這一結構域的功能，結果發現，repA 主要負責識別和剪切質粒 DNA。隨後對 PIWI這一結構域的功能測定顯示，其結果類似於 repA，也具有 DNA 剪切作用。因此，負責實驗的 Kevin V. Solomon 教授斷定，NgAgo 是一個核酸內切酶，且依賴於 repA 和 PIWI 實現其 DNA 酶切功能。

　　因為哺乳動物體內具有組蛋白，對 pAgo 的活性均具有抑制作用，研究人員選擇了在大腸桿菌體內測試 NgAgo 的作用，結果顯示 NgAgo 可在大腸桿菌內進行 DNA 剪切功能，同時更為細緻的研究表示，PIWI 結構域對於靶向剪切並不是那麼重要，其可隨機剪切一部分 DNA，但對於調控整個 NgAgo 的功能至關重要。另外，repA這一結構域則主要負責靶向剪切。PIWI 和 repA 這兩個結構域對於 NgAgo 在原核生物中實現其 DNA 內切功能均十分重要。

　　從普渡大學的結果來看，NgAgo 無論在體內體外均可實現其 DNA 內切的作用。在體外實驗中，可溶且非再摺疊的 NgAgo 可切割靶向的 DNA 鏈，在大腸桿菌內 NgAgo 在名為 repA 和 PIWI 兩個功能性結構域的幫助下，NgAgo 可通過誘導其蛋白內靶向序列的雙鏈斷裂進而增強菌體內的基因同源重組。

　　這些研究從側面證實了 NgAgo 確實具有 DNA 內切作用，是一個名副其實的 DNA 內切核酸酶，同時也表明，可溶性的 NgAgo 可以切割靶向區的 DNA。在這一過程中，PIWI 結構域的缺失會導致靶向基因的識別困難，進而降低 NgAgo 的 DNA 剪切力。

　　圖丨劉東團隊發現 NgAgo 誘導的 fabp11a 基因敲除可導致斑馬魚眼睛發育缺陷（來源：NgAgo-based fabp11a gene knockdown causes eye developmental defects in zebrafish）

　　在普渡大學的這個研究之前，還有兩次來自國內的關於 NgAgo 的研究進展也值得注意。

　　2016 年 11 月，中國南通大學劉東團隊的研究成果表明，NgAgo 可以在 gDNA 的引導下與靶基因相結合，同時可以抑制靶基因的轉錄過程，進而降低靶基因的表達水平，但該團隊也否認了 NgAgo 具有 DNA 酶切作用，不具備 DNA 編輯功能。這篇文章發表於 2016 年 11 月 11 日的Cell Research雜誌。

　　令人意外的是，在 2019 年 1 月 22 日，中國學者張安定教授的研究團隊發布成果表示，pAgo 可以增強細菌同源序列的定向重組，並證實 NgAgo 系統通過其類似 PIWI 結構域與重組酶 A（recA）相互作用進而增強 recA 介導的 DNA 鏈的重組。他們的研究揭示了一種增強同源性序列引導的細菌基因編輯系統。研究發表於Nucleic Acids Research雜誌。

　　圖丨多殺巴斯德氏菌和大腸桿菌中的 NgAgo 基因編輯系統（來源：The prokaryotic Argonaute proteins enhance homology sequence-directed recombination in bacteria）

　　以上的這些研究都表明，NgAgo 具有可編程的 DNA 切割能力。但需要注意的是，作為基因編輯應用的強大工具，NgAgo 的開發仍存在若干挑戰：高脫靶活性，隨機性剪切率高，表達低，在真核宿主中潛在的低活性。儘管如此，進一步的研究可能會利用蛋白質工來克服這些障礙，並開發 NgAgo 作為基因編輯的強大工具。

　　對於科學家在 NgAgo 上取得的最新進展，中科院遺傳與發育研究所高級工程師姜韜對 DeepTech 表示，這個工作還是非常初步的，很多實驗結果不夠理想。

　　「比如，用大腸桿菌表達NgAgo 蛋白是存在包涵體的，而且包涵體復性不成功，可溶性部分不能排除摺疊不正確的NgAgo。同時，沒有看到 NgAgo 的純度數據和證據，而大腸桿菌自身的DNA 內切酶很多,活性也高，必須徹底排除。這類實驗要求陰性、陽性對照藥充分，我也沒有看到完備的實驗證據。整個工作最有價值部分是實現了在大腸桿菌細胞內實現了增加目的基因的重組率，這是一個旁證，遺憾的是這個基因組編輯究竟是否真實，沒有後續的DNA 測序結果給與直接的證明。作者聚焦研究的NgAgo 能否在真核細胞內實現 DNA內切，是能夠作為成熟的基因組編輯工具的最基本條件，目前還是沒有進展。我個人以為，目前的結果難以通過嚴格的同行評議，必須完善和補充我上面提出幾點重要實驗」，他說。

　　（來源：普渡大學）

　　他透露，很多科學家都清楚NgAgo 的潛在優點-不受額外的鄰近序列（PAM）限制，意味著可以編輯任意部分。相信我國的韓春雨也注意到了，但他沒有真正重複出做出其聲稱的基因組編輯，其他科學家也沒有按照他提供的方法做出NgAgo 的基因組編輯。普渡大學的成果是個初步結果，甚至很粗糙，仍然需要完善和補充實驗，如果真實可行，還需要以建立起穩定可靠的實驗條件，並給出基因組編輯成功率和脫靶比例的數據。

　　還有一點要指出的是：不論別人在NgAgo 上做出了什麼新進展，韓春雨都需要自己重複出他發布的那個實驗。

　　總而言之，在之前的鬧劇之後，依然有學者正在致力於發展 NgAgo 技術，普渡大學的最新成果再次將 NgAgo 推到全球基因編輯研究者的眼前，表明其確實具有作為 DNA 編輯工具的潛力。雖然這一「利器」在真核生物並未發現其內在的 DNA 編輯能力，但這一研究結果也足以讓研究者們振奮。相信隨著對 NgAgo 的不斷認識和開發，我們有希望找到另一款強大的DNA 編輯利器。

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　　編輯：Michael 責編：黃珊

　　參考：

　　Paula Pandolfi, Frederick S. Gimble, Kevin V. Solomon. NgAgo-enhanced homologous recombination in E. coli is mediated by DNA 1 endonuclease activity

　　坐標：北京·國貿

　　請隨簡歷附上3篇往期作品（實習生除外）