摘要
眾所周知，維生素是作為一種缺氧誘導劑來抑制分枝桿菌的生長。在研究由維生素C引起的缺氧條件如何影響分枝桿菌噬菌體生長時，使用恥垢分枝桿菌噬菌體D29作為模型系統，結果顯示，事先將宿主暴露於缺氧條件下使噬菌體的釋放量增加。維生素C預處理也可誘導宿主同步生長。DevR是控制分枝桿菌缺氧反應的反應調節劑，其突變體缺陷既不能支持更高的噬菌體釋放，也不能使宿主在維生素C預處理後進行同步生長，這表明這兩種現象是相互關聯的。
支持這種相互關係的進一步證據來自於噬菌體的釋放量隨宿主細胞所處的同步生長階段的變化而變化現象的發現。在感染時-在靜止/合成階段觀察到更高的釋放並且觀察到更低的區分度。這種效應在本質上是特殊的，因為通過一種被稱為「擁擠」的不相關方法的同步不會導致相同的結果。結果表明，維生素C處理引起的生長同步是一種依賴於DevR的現象，而噬菌體D29利用了這一現象得以大量生長。
文章信息如下：
背景介紹
休眠的結核分枝桿菌可在受感染的宿主中存活較長時間，從而導致持續性結核病（Zhang 2004）。當培養基中的氧含量下降(缺氧)時，就會出現類似休眠的情況（Wayne 1994; Wayne and Hayes 1996）。多種方法可以誘導缺氧條件，用維生素C處理就是其中一種誘導方法，而維生素C是一種眾所周知的還原劑（Taneja et al.2010）。在這種條件下，分枝桿菌的休眠調節子被激活。 這種激活是由稱為DevS-DevR（也稱為DosS-DosR）的雙組分信號系統引起的。在該系統中，DevS是感覺組分，DevR是反應調控因子（Dasgupta等人2000; Boon和Dick 2002; Saini等人2004）。休眠調節基因(Park et al. 2003)的表達依賴於DevR，它是維持休眠狀態所必需的。DevR在毒理過程中的作用仍然很神秘。在一項特定的研究中，有報導稱，編碼調控因子的基因(devR)被敲除的突變體結核分枝桿菌具有超毒力(Parish et al. 2003)，而在另一項研究中觀察到的情況正好相反(Mehra et al. 2015)。各種實驗室對devR突變體表型的觀察結果的矛盾性使我們得出結論，DevR的作用方式非常複雜。
分枝桿菌噬菌體被認為是分枝桿菌研究的基石（Hatfull 2010）。它們已被用於開發分枝桿菌基因工程的各種工具（Lee等1991; Pearson等1996; Pashley和Parish 2003; van Kessel，Marinelli 和Hatfull 2008）。對噬菌體比較基因組學的研究揭示了許多編碼蛋白質的新基因的存在，這些蛋白質的功能尚不清楚(Pope et al. 2011)。本實驗室一直致力於一種名為D29的噬菌體的研究，該噬菌體以裂解模式感染分枝桿菌屬的各種物種。 它與另一種稱為L5的分枝桿菌噬菌體密切相關，並且它很可能是由L5衍生而來（Hatfull和Sarkis 1993; Ford等1998）。初步研究表明，這些噬菌體的感染可以導致宿主失活。儘管本實驗室最近的研究表明該過程可能涉及多種機制，包括產生超氧自由基（Samaddar等人，2015），誘導胸腺嘧啶減少死亡（Ghosh et al。 2015）和環核苷酸單磷酸酯的水解（Dutta，Bhawsinghka和Das Gupta 2014），但是這個過程到底是如何發生的仍然不清楚。
鑑於噬菌體D29感染宿主細胞不僅可以為我們提供這些噬菌體分子生物學的相關信息，還可以為我們提供關於宿主細胞本身的信息(Hatfull 2014)，所以我們試圖研究維生素C預處理宿主細胞對噬菌體生長的影響。之所以選擇維生素C，是因為有證據表明，維生素C可以作為氧清除劑(Taneja et al. 2010)或還原劑(Honaker et al. 2010)或兩者兼用來抑制分枝桿菌細胞的生長。我們想要研究維生素C誘導的宿主代謝紊亂如何影響噬菌體的生長。 在進行該項調查時，我們發現維生素C預處理細胞中的噬菌體生長增加。經過進一步研究，發現維生素C預處理導致恥垢分枝桿菌宿主細胞依賴DevR生長同步，這種現象反過來對分枝桿菌噬菌體D29的生長有一定的促進作用。
方法
細菌，噬菌體和質粒
恥垢分枝桿菌mc2155，在此稱為MSM，作為分枝桿菌噬菌體D29感染的宿主菌株。分枝桿菌噬菌體D29（Ford等人，1998）是由Ruth McNerney博士惠贈。將潮黴素基因盒插入一株恥垢分枝桿菌中，使DevR失活，該菌株由Huw D. Williams博士(O 'Toole et al. 2003)饋贈。該菌株將在本研究中稱為MSM（devR）。其中另一種DevR突變的菌株MSM（comp）被開發作為本研究的一部分。簡而言之，使用引物正向引物（GGCATATGATGGTGACAGTCTTTCTCGTCG）和反向引物(RP) （GGGCTAGCTCAGTATTGCTCGTCGTGGTGG）擴增MSM的devR基因（MSMEI 3853）並利用NdeI和NheI限制性酶切位點(下劃線)將其克隆到乙醯胺誘導的分枝桿菌表達載體pLAM12上 (van Kessel, Marinelli和Hatfull 2008)。對於MSM (comp)，在實驗開始之前通過添加0.2％乙醯胺（Parish等人1997; van Kessel和Hatfull 2008）對devR進行3小時的誘導表達。
細菌和噬菌體生長條件
分枝桿菌細胞在含有0.2％甘油的Middle-Brook 7H9（Difco）培養基中，同時在溫度為37℃，轉速為120rpm/min振蕩培養箱中生長。通過測定培養基在595nm處的光密度（OD595）或每毫升存在的菌落形成單位數（CFU / ml）來測量細菌生長。通過向濃度為5mM的分枝桿菌細胞中添加維生素C來產生缺氧條件（Taneja等人，2010）。通過觀察加入的亞甲基藍（3μg/ ml）的脫色或直接用生物氧監測儀（S300A，YSI Bioanalytical Products）測量溶解的O 2含量來測定維生素C消耗O 2的程度。除了用維生素C處理外，另一種被稱為「擁擠」的情況也被用於限制分枝桿菌的生長。在該方法中（Yanagita和Kaneko，1961; Ono等，1963），宿主細胞在20ml培養基中過夜培養至OD值為 0.2-0.3。將20ml培養基中的總細胞沉澱下來並重懸於1ml新鮮培養基中以小量收集細胞。 為了回收，用新鮮培養基將細胞稀釋約100倍直到OD595值為0.1-0.2。
用噬菌體D29感染，同時使用OD595生長至0.3的MSM。 在感染實驗中，用感染複數（MOI）為0.1的D29感染10ml細胞。用噬菌體稀釋培養基（PDM）（0.1％胰蛋白腖，0.2％MgCl 2,0.85％NaCl和2mM CaCl 2）進行噬菌體稀釋和感染實驗（Chaudhuri等人，1993）。裝有感染細胞的100 ml燒瓶放入37℃，輕輕震蕩(120 rpm)吸附15分鐘，然後將感染細胞稀釋104倍，阻止進一步吸附(Young, Ohman和Sjoberg, 1994)。在不同生長階段測定噬菌體產量(形成菌斑單位或PFUs)。
釋放量和感染率的測定
吸附再稀釋後，將懸浮液平均分為1ml，離心使沉澱與上清液分離。將沉澱懸浮於PDM中，測定懸浮液中感染中心（IC）的數量。分別評估上清液中是否存在未吸附的噬菌體（PU）。剩餘的部分在37℃的振蕩條件下孵育，使噬菌體完成生長和裂解。將由此得到的裂解物離心除去碎片，並測定上清液中存在的PFU數（最終計數或PF）。通過如下公式計算噬菌體的釋放量（PB）和感染比率（I）：PB = PFIC-PU和I = IC + ICPU×100。在一些實驗中，在不稀釋吸附後的噬菌體懸液的情況下，在3-h時間內直接監測噬菌體的生長(擴增)。用最終存在的PDU的數量除以最初存在的PDU的數量來測量擴增的程度。
統計分析
所有感染實驗都進行了三次重複，結果以平均值（實驗間）±標準偏差（SD）表示。通過Student's t檢驗對組平均值進行比較。P值<0.05時，差異被認為是有統計學意義的。
結果
維生素C對分枝桿菌細胞生長的影響
圖1. 維生素C對分枝桿菌生長的影響。
（A）如表所示，不斷增加維生素C的濃度處理MSM培養物，MSM培養物中溶解氧含量隨時間的變化。紅色跡線表示當使用最大濃度的維生素C（5mM）時觀察到的模式。紅色箭頭表示亞甲藍在類似條件下脫色的時間點。
（B）維生素C處理或未處理的分枝桿菌細胞的存活動力學，MSM或MSM（devR）（分別為B1和B2）。隨後將培養過夜至OD595為0.5的細胞在振蕩條件下，並在存在或不存在（未處理）的維生素C（5mM）下孵育7小時（420分鐘）。樣品每隔一小時回收一次，並進行CFUs測定。(B)中的每個數據點代表來自三個生物學重複實驗的平均CFU / ml±SD。
在之前的研究中(Taneja et al. 2010)，已經證明了維生素C可以作為缺氧誘導劑。為了證實維生素C能有效地耗盡O2，本研究中，在將維生素C加到處於指數生長期的MSM培養物中的條件下，使用O2監測設備以及通過觀察亞甲藍的脫色來監測O2的消耗程度。結果表明，在加入濃度為5mM的維生素C的10分鐘內，O2水平降至可檢測水平以下（圖1A，紅色跡線）。 如果存在這種情況，亞甲藍在添加維生素30分鐘後脫色（紅色箭頭）。在之前的一項研究中已經證明，維生素C治療結核分枝桿菌3天會導致羥基自由基（HO•）的大量釋放（Vilcheze等，2013），從而導致細胞死亡。在本次研究中，維生素C暴露的時間相對較短，僅為3小時。為了檢查這種短時間處理是否導致HO•的產生，使用超氧自由基特異性螢光染料二氫乙錠進行基於FACS的分析（Vilcheze等人，2013）。結果表明，幾乎沒有任何HO•被釋放。
然後，在添加維生素C (5 mM)後的7小時(420分鐘)內，通過監測活細胞計數(CFU/ml)來檢測存在或不存在維生素C時，MSM的生長特性。觀察到，與未經處理的細胞相比，經維生素C處理的細胞生長緩慢(圖1B1正方形與圓形相比)。在120分鐘後，活細胞計數（CFU）的差異開始顯現(圖1B1)。然而，有趣的是，當使用MSM(devR)進行相同的實驗時，並沒有觀察到生長遲緩的現象(圖1B2)。結果表明，維生素C處理不僅可以導致生長遲緩，而且實驗中所觀察到的現象與DevR有關。
維生素C對噬菌體生長的影響
圖2.（A）維生素C預處理的MSM細胞中噬菌體D29的增殖。細胞用濃度為5mM的維生素C預處理3小時或不處理，然後清洗並導入新鮮生長培養基中，再用MOI為0.1的D29感染。增殖率是輸出和輸入PFU之間的比率。
（B和C）在用維生素C或DHA預處理宿主細胞後，分別測定釋放量和感染中心形成百分比。
（D）devR突變對釋放量增加的影響。將宿主細胞與濃度為5mM的維生素C預接觸 3小時後計算釋放量。如圖所示，用三種菌株MSM，MSM（devR）和MSM（comp）進行實驗。黑色和白色條代表在感染前用維生素C處理或未處理的細胞中D29的釋放量。顯示了顯著性水平（P值）0.005（**），0.0005（***）和> 0.5（非顯著性，ns）。
先前已有文獻記載，如果用維生素C處理，噬菌體會失去活力(Richter和Loewen 1982)。因此，為了研究維生素C對噬菌體發育的影響，用維生素C處理後的宿主細胞被洗滌，然後在新鮮培養基中重懸。結果顯示，在用維生素C預處理細胞的情況下，噬菌體擴增幾乎是未處理的兩倍（圖2A）。為了檢驗這種影響是由於吸附效率的改變還是由於釋放量的改變，分別監測感染百分比和釋放量(圖2B和圖C)。結果表明，預處理維生素C的感染細胞中噬菌體的釋放增加是由於較高的釋放量（圖2B），而不是由於吸附效率的變化，因為無論是否進行維生素C預處理，感染率幾乎保持不變（圖2C）。然而，在5mM脫氫抗壞血酸（DHA）預處理的情況下未觀察到釋放量的增加（圖2B）。DHA是維生素C的氧化形式，它可以被細胞吸收並在體內轉化為還原形式(Eddy 1952;艾迪和英格拉姆1953)。因此，如果維生素C作為輔助因子發揮作用，而不僅僅是作為還原劑，那麼添加DHA或維生素C都會導致同樣的結果。而事實並非如此，說明維生素C起重要作用是它的還原功能，而不是其分子本身。
為了研究調節因子DevR是否與上述現象有關，使用DevR缺失菌株MSM（devR）重複了釋放量實驗（圖2D）。結果顯示，用維生素C預先處理MSM 3小時，導致釋放量增加（圖2D，黑色條與白色相比）。然而，在MSM (devR)中不能複製這種效應，但是在突變體的互補株MSM (comp)中可以再次看到這種現象。這些證據清楚地表明了DevR在觀察到的現象中起作用。
缺氧恢復期間MSM的生長模式
圖3.維生素C處理後的恢復過程中分枝桿菌細胞的生長動力學。將菌株MSM（A和D），MSM（devR）（B和E）和MSM（comp）（C和F）培養過夜至OD595為0.3-0.5並分成兩個部分，使其中一個不經任何處理（綠色痕跡），而另一個用濃度為5mM維生素C處理（紅色痕跡）3小時（180分鐘）。然後洗滌維生素C處理的細胞並重新懸浮在新鮮培養基中（黑色箭頭）。然後通過測定OD595（A-C）和CFU（D-F）9小時（540分鐘），每隔30分鐘監測經維生素C處理（紅色）和未處理（綠色）細胞的生長。把添加維生素C的時間點認為是零。對於CFU計數，進行三次實驗並計算了平均值±標準誤差。
上一節報導的結果表明，噬菌體在維生素C預處理細胞中生長的能力顯著提高。然後觀察相同條件下(維生素C預處理)對宿主細胞生長的影響。細胞在維生素C的存在下培養3小時(180分鐘)，然後洗滌細胞，懸浮在新鮮的培養基中。然後通過光學密度測量(圖3A-C)和CFU計數(圖3D-F)監測預先接觸維生素C的細胞的生長(圖3中的紅色痕跡)。為了同時控制監測未經維生素C處理的細胞的生長(綠色痕跡)。
這些實驗的結果顯示，在培養基發生改變時（黑色箭頭），與未處理的相比（圖3紅色跡線與綠色相比），在用維生素C處理MSM（圖3A和D）和MSM（comp）（C和F）的情況下OD595和CFU計數較低。然而，在MSM（devR）（B和E）的情況下， OD595和CFU計數幾乎保持不變。在MSM和MSM（comp）兩個實例中，維生素C處理導致生長遲緩，在恢復期間觀察到一個特定模式，其中細胞密度（OD595）（圖3A和C）和活菌數（CFU / 發現（D和F）以逐步方式增加（與綠色相比為紅色痕跡），這意味著同步生長。然而，對於MSM（devR）（圖3B和E以及圖S2，補充信息）來說，維生素C預處理後，這種生長模式的改變並不明顯，它繼續以與對未經接觸維生素C的細胞非常相似的方式呈指數增長。
結果表明，DevR在依賴維生素C的同步現象中起一定作用。上述實驗重複至少兩次，每次都得到相似的結果。
在宿主細胞同步生長中調節噬菌體釋放
圖4.同步增長的不同階段的釋放量的變化。如上所示，通過進行擁擠或維生素C處理來嘗試使MSM（A），MSM（devR）（B）和MSM（comp）（C）細胞同步化。三種菌株中各有一批在沒有任何處理（未處理）的情況下生長的細胞作為相應的對照組。每隔20分鐘通過測量光密度（OD595）和CFU / ml（分別為上圖和中圖）監測一次細胞生長狀況。然後測定細胞在指定時間點（生長曲線中編號為1-5，相應地在條形圖的橫坐標中）釋放量（下圖，條形圖）。把去除維生素C和添加新鮮培養基的時間點認為是零時間。在CFU的情況下，顯示了從三個平板±標準誤差獲得的平均值。對於釋放量測定（黑條），遵循一式三份感染分枝桿菌培養物的常規做法。因此，該值代表來自三個獨立感染實驗±SD的平均值。必要時發現相關的顯著性水平（P值）0.005（**），0.0005（***）和> 0.5（非顯著性，ns）。
宿主細胞生長的同步可能導致噬菌體釋放增加(Starka 1962;storm等，2014)。為了檢驗這是否也適用於分枝桿菌噬菌體，我們研究了宿主細胞同步化對D29增殖的影響。為了誘導同步，使用了兩種不同的策略。 在第一種情況下，使用維生素C處理作為同步工具，而在第二種情況下，使用「擁擠」的方法。 在後一種方法中，先將指數生長的細胞限制在小體積中導致生長抑制，然後突然稀釋到新鮮的培養基中來完成同步（Yanagita和Kaneko，1961; Ono等，1963）。通過擁擠或維生素C預處理使細胞同步化對噬菌體釋放增加有促進作用，然後相互比較這兩種處理方式，同時與不同步生長方式的比較（未處理，圖4）。採用三種MSM菌株進行實驗：野生型MSM，MSM（devR）和MSM（comp）（分別為圖4A，B和C）。每隔20分鐘時間（由編號箭頭指示）從培養基中回收細胞，用噬菌體感染並測定釋放量。在之前的實驗中我們觀察到，用維生素C預處理MSM和MSM (comp)(圖4A和C)，而沒有對MSM進行預處理 (devR)(圖4B)，可以引起同步生長(在A-C中的上、中面板)。擁擠也可以誘導同步。有趣的是，當使用擁擠處理方法時，產生了抵抗維生素C預處理同步的MSM(devR)菌株 (圖4B)。當使用處於不同生長階段的細胞（編號箭頭）進行噬菌體測定時，發現在維生素C預處理的MSM和MSM（comp）細胞的情況下（分別在圖4A和C中的條形圖） 釋放量通常高於在未經處理或通過使細胞「擁擠」進行處理的細胞的情況下的釋放量。然而，有一個例外，在時間點3收穫的細胞促進基礎水平的釋放（圖4A和C，維生素C）。總體而言，在維生素C預處理後，釋放量隨著宿主細胞(MSM或MSM (comp))從一個同步生長階段過渡到另一個同步生長階段，呈擺動變化。可以看出，在40分鐘的中間時間點（時間點3），釋放量較少，細胞處於分裂階段（它們的數量隨時間增加），而在時間點1和2也是如此。 在4和5時，他們似乎正在休息。可以看出,在40分鐘的中間時間點(時間點3),在釋放量少,細胞分裂階段(它們的數量隨著時間的增加),而在時間點1和2以及4和5也是如此,他們似乎在休息。但是，在擁擠同步的情況下沒有觀察到這種現象，這表明重要的不僅是同步，而且還有實現同步的方法。最後，本研究結果中最重要的方面是MSM(devR)菌株對維生素C預處理的反應方式(圖4B)。首先，儘管它確實對擁擠做出反應，但它不能通過添加維生素C來實現同步。 其次，在維生素C預處理（圖4B，條形圖）或者擁擠的情況下，均未觀察到MSM(devR)的釋放的振蕩表型。第三，釋放量始終處於基礎水平，從未達到維生素C同步MSM和MSM(comp)細胞中所達到的高水平。因此，研究結果清楚地表明，這種差異效應在本質上是特定的，並且只有一種類型的同步，其中DevaR起著重要作用，給出了積極的反應所觀察到的振蕩現象是可重現的，從圖S3所示的重複實驗的結果可以明顯看出。
討論
分枝桿菌通過轉變為休眠狀態對低氧條件作出反應。儘管其特徵之一是細胞停止複製，但是休眠發展的確切機制尚不清楚，換句話說，它們的生長被阻止了（Wayne和Hayes，1996）。
本研究結果表明，在維生素C誘導的缺氧條件下，以DevR依賴性方式導致了恥垢分枝桿菌細胞的生長停滯。這一觀察結果與之前的結核分枝桿菌研究結果相矛盾（Taneja等人，2010），其中發現DevR在類似情況下沒有發揮作用。觀察結果差異背後的原因尚不清楚。這可能是由於在這兩項研究中使用的分枝桿菌種類不同，這裡使用的恥垢分枝桿菌和前一種結核分枝桿菌，以及/或涉及到的時間尺度，是小時而不是天。維生素C已被證明可以通過創造低氧環境(Taneja等，2010)或通過刺激羥基自由基的形成來抑制分枝桿菌的生長(Vilcheze等，2013)。因此，可能出現這樣的問題：這兩種可能的機制中的哪一種與本研究中觀察到的生長遲緩現象有關。雖然兩者都可能涉及，但似乎超氧化物自由基的產生不是主要原因。降低這些自由基參與的原因如下。 首先，在維生素C處理3天後形成氧化應激所必需的自由基的臨界水平（Vilcheze等人2013），在數小時內就可以觀察到效果。此外，在本研究中使用的條件下，我們沒有觀察到恥垢分枝桿菌細胞與維生素C孵育後的任何超氧自由基釋放。最後，沒有跡象表明維生素C處理引起的氧化應激是依賴DevR所產生的現象(Vilcheze et al. 2013)，而這裡的所有觀察結果都已被最終證明是依賴DevR的。因此，儘管維生素C的作用可能是多效的（Taneja等人，2010; Sikri等人，2015），但這裡觀察到的似乎僅僅是由於它誘導的缺氧條件。
在恢復階段，在維生素C處理後，細胞傾向於同步分裂。早前就有報導稱，在氧誘導的生長停滯之後，牛分枝桿菌BCG細胞 (Lim et al. 1999)，和恥垢分枝桿菌均會發生同步生長(Dick, Lee和Murugasu-Oei 1998)。然而，這是第一次報導DevR參與同步過程。理想情況下，在同步生長的培養中，細胞數量有望逐步增加，在無生長期(平穩期)之後，細胞數量會急劇上升。在這種情況下，平臺期應與生成時間一致。在該研究中，觀察到的平臺期在20至40分鐘之間變化，這小於恥垢分枝桿菌的接受的2.5小時生成時間（Dick，Lee和Murugasu-Oei 1998）。在這種情況下，高原期應與生育期一致。在本研究中，觀察到的高原期在20到40分鐘之間變化，小於M. smegmatis公認的2.5 h的世代時間(Dick, Lee and Murugasu-Oei 1998)。這種差異可能是由於完全同步難以實現，因為同步誘導劑可能對細胞的一般生理機能產生一些不利影響。因此，即使在同步之後，在生成時間內也總是存在細胞間的變異(Campbell 1957)。對於分枝桿菌而言，親代細胞的額外併發症導致子代以不同的速率生長（Aldridge等人，2012; Santi等人，2013）。 這種變化可能導致上升期變淺並且平臺時期變短。
細菌細胞周期可分為三個不同的階段，B，C和D（Wang和Levin，2009）。B是靜止期，C是DNA合成期。 D是細胞分裂和數量增加的最後階段。本研究結果表明，在D期(圖4中為時間點3)細胞數量增加時，釋放量較低。另一方面，它在B/C相中更高。最有可能的是由於高水平的DNA合成活動在C階段特別有助於病毒更快速的生長。與缺氧相反，擁擠方法不會導致更高的釋放。 為了使同步發生，首先必須通過抑制特定的生化途徑來阻斷某一階段的細胞周期。隨著抑制作用的解除，所有的細胞都以同步方式重新激活被阻斷的生化通路。如果該途徑對噬菌體有利，則預期其繁殖會增加。然而，如果與噬菌體無關，則不會產生效果 因此，噬菌體是否與同步有關取決於涉及哪種途徑。 我們假設DevR阻止DNA複製起始。在所有細胞中同步重啟DNA合成，將有助於噬菌體有效地複製其DNA。在「擁擠」的情況下，該部分似乎處於細胞分裂的水平，而不是DNA合成的水平(Yanagita和Kaneko 1961)。因此，通過擁擠進行同步可能對噬菌體不利。總的來說，本研究中提出的現象可概括如下。除去維生素C後，所有細胞以協同的方式恢復生長，導致群體相對於噬菌體生長所必需的一些宿主因子變得均勻富集。總的來說，本研究中出現的現象可以總結如下。去除維生素C後，所有的細胞都以協調一致的方式恢復生長，導致群體相對於噬菌體生長所必需的一些宿主因子變得均質富集。均質化群體中的所有細胞（同步的）將促進噬菌體生長到相同程度，而在異質培養物中（非同步的），隨機分布的細胞中只有一小部分具有最優水平的因子。因此，平均而言，同質群體將促進更高的釋放。
然而，這並不是同步細胞中噬菌體生長增加的第一例報導。早前，這種現象已經在大腸桿菌噬菌體T2r (Starka 1962)中得到證實。發現這種噬菌體的釋放量在一個同步生長的培養物的連續分裂階段之間的時期比在階段本身的時期要高。最近的一篇論文(Storms et al. 2014)也進行了類似的觀察，研究了宿主大腸桿菌細胞同步化對T4噬菌體生長的影響。在細胞分裂開始之前立即觀察到這種情況下噬菌體的最大產量。 在這項關於分枝桿菌噬菌體的研究中，已經報導了幾乎相同的現象，除了通過誘導缺氧引起宿主細胞暴露於維生素C誘導同步，這是一種在生理上極其重要的病症，特別是在TB的情況下（Chao和Rubin）2010）。在本例中，噬菌體的最大產量是在細胞分裂開始之前立即觀察到的。mycobacteriophages在這項研究中,一個幾乎相同的現象據報導除了同步被暴露誘導宿主細胞的維生素C,通過缺氧誘導的條件是非常重要的生理特別是結核病的上下文(曹國偉和魯賓2010)。在細胞分裂開始之前立即觀察到這種情況下噬菌體的最大產量。在這項關於分枝桿菌噬菌體的研究中，除了通過維生素C處理誘導缺氧引起宿主細胞同步，這是一種極其重要的生理狀況，已經報導了幾乎相同的現象，特別是在結核病的情況下。