NGS技術落地病理科,加速分子診斷臨床應用發展

2020-12-06 騰訊網

當前，腫瘤個體化治療已從美好的願景逐漸步入臨床實踐。基於分子分型的靶向治療、免疫治療等精準治療手段使腫瘤患者生存期及生活質量得到顯著提高。在這一趨勢下，以新一代測序（NGS）技術為代表的靶向精準檢測方法逐漸從科研實驗室走向臨床病理科的實際應用中。

2019中國病理年會期間，在羅氏診斷主辦的「NGS助力分子病理臨床研究專題研討會」上，我國多位分子病理領域知名專家學者共同探討了NGS在分子病理診斷中的應用前沿進展。中華醫學會病理學分會常委兼秘書長、首都醫科大學宣武醫院病理科盧德宏教授擔任會議主席並表示：「NGS等先進檢測技術的發展正推動著病理學科加速變革。進入精準醫療時代，病理學科的重要性愈加凸顯，如何充分發揮分子病理等新興學組的臨床價值是我們每一位病理醫生需要關注的重點。」

中華醫學會病理學分會常委兼秘書長、首都醫科大學宣武醫院病理科盧德宏教授

NGS：現代臨床實踐的必經之路

「精準醫療要求病理醫生掌握患者儘可能詳細的信息，包括年齡、性別、基因、既往疾病史、家族譜系、生長環境、生活方式等。個體化差異會影響每位患者的疾病特徵，也意味著每個人的疾病預防、診斷和治療方式可能不同。」蘇州大學附屬第一醫院病理科主任郭凌川教授指出，「現代病理醫生的工作不再僅僅是提供一個診斷結果，而是整合所有患者信息給予臨床疾病全程管理的指導。」

蘇州大學附屬第一醫院病理科主任郭凌川教授

分子生物學、分子遺傳學技術的進步推動著病理診斷從傳統的形態學深入至分子層面研究，通過分析腫瘤患者的基因異常情況，包括常見的基因擴增、染色體異位/基因融合、基因突變、基因重排、甲基化、微衛星不穩定（MSI）等，為病理診斷、臨床治療提供更多有價值的信息，發現對不同治療方式更為敏感、療效更好的患者群體，有助於臨床制定個體化治療方案，指導伴隨診斷用藥、監測療效及判斷預後等。

目前，分子病理診斷技術已應用在肺癌、結直腸癌、淋巴癌、乳腺癌等臨床常見腫瘤的診療中。其中，與雙脫氧法測序（sanger）、聚合酶鏈式反應（PCR）等傳統檢測方法相比，NGS技術具有明顯的通量優勢，可在一次檢測中對上百萬甚至數十億個DNA分子進行大規模重測序，從而繪製更為全面的疾病基因譜。此外，NGS可同時對數百種基因的突變、插入缺失、融合、拷貝數變異進行檢測，尤其對於形態學診斷有爭議的疑難病例，NGS技術能夠最大程度上幫助患者找到有用的治療靶點和預後標誌物，實現真正意義上的「精準醫療」。相對於傳統病理檢測，NGS技術具有更快速度、更高通量、低成本人員依賴、省時、省樣本、節約成本等優勢，且能提供更豐富的信息以及更多治療選擇。

臨床上，針對腫瘤基因外顯子或單核苷酸多態性（SNP）位點進行NGS檢測，可用於判斷家系成員的患病風險。針對乳腺癌、結直腸癌等具有遺傳性傾向的癌症（如圖1），美國國立綜合癌症網絡（NCCN）給出了明確的風險評估及預防監測指導，要求符合遺傳學入組標準的人群進行相關易感基因突變檢測，並根據評估結果選擇合適的預防或幹預措施，在腫瘤防治工作中具有重要實用價值與意義。

圖1：多易感基因突變致乳腺癌、結直腸癌發生風險升高

NGS指導腫瘤精準診療

郭凌川教授表示：「基於NGS的腫瘤組織體細胞突變檢測能夠提供指導多種腫瘤的靶向用藥信息。結合臨床實際需求，我們可以為患者靈活設計特定病種的靶向測序方案，找到能夠實現臨床獲益的分子突變。需要注意的是，腫瘤在進展過程中，由於微環境的改變或藥物幹預後疾病可能發生變異，需要實時監測並調整治療方案。」

腫瘤突變負荷（TMB）是免疫治療中應用最多的分子標誌物之一。2017年《新英格蘭雜誌》發表的27種癌症的TMB與應用PD-1/PD-L1抑制劑治療有效率的分析顯示：各大常見腫瘤接收PD-1抑制劑治療的有效率和TMB大小几乎呈線性關係（如圖2），即TMB越高，PD-1抑制劑有效性越高。[1]

圖2. TMB在不同癌種中的分布及相應PD-1/PD-L1抑制劑治療有效率

2018美國臨床腫瘤學會（ASCO）年會上，來自瑞士洛桑大學醫院的Solange Peters教授總結了晚期NSCLC免疫治療前沿進展（如圖3），提出TMB與PD-L1表達並不完全相關，需要兩種生物標誌物聯合運用。

圖3. PD-L1聯合TMB檢測應用價值

值得注意的是，免疫治療可能引起負反應，甚至出現免疫治療超進展（HPD），即PD-1/PD-L1治療前後腫瘤增長速度（TGR）絕對增加超過每月50%，這與MDM2/MDM4 擴增/突變、EGFR突變、DNMT3A突變、11q13擴增、CDKN2A/B缺失等有關（如圖4）。這些基因檢測能夠及時提示患者治療是否出現HPD。此外，HPD還和年齡相關，年齡較大患者容易出現HPD。

圖4. 免疫治療相關分子標誌物[2]

先聲診斷市場高級總監宋超介紹道：「完整、全面的基因檢測不僅有助於臨床制定治療方案，其耐藥檢測分析能幫助靶向耐藥患者及時更換合適的靶向藥物，對於罕見突變的發現則有利於指導科研方向。最新發布的多項研究顯示，某些驅動基因陽性的患者免疫治療獲益較差，對此類患者及時進行全面的基因檢測，有助於他們儘早更改治療方案，提高療效。」

先聲診斷市場高級總監宋超

加強質控

規範NGS技術在病理科的應用

樣本的不同處理狀態會直接影響NGS的檢測結果，因此，對樣本製備的質量控制不容忽視。《腫瘤個體化治療檢測技術指南（試行）》建議樣本採用10%中性福馬林固定，按病理學操作規範進行取材；活檢標本固定24小時，穿刺樣本固定時間控制在6~24小時為佳；樣本經1周以上的長時間浸泡後部分DNA會被片段化，並不能檢出突變，對診斷結果產生影響。

在組織切片方面，建議切取5張連續切片，其中1片進行HE染色，確認腫瘤細胞的含量。過低的腫瘤組織含量會直接影響腫瘤基因突變豐度，造成假陰性，因此，每張切片腫瘤組織的含量至少在70%以上。

隨著介入技術的進步，穿刺小標本檢測增加了組織標本的獲取途徑。穿刺石蠟標本進行NGS檢測可以提供更直接的信息，1~2張石蠟切片（2ng DNA）即可滿足測序需要。不同檢測方法DNA樣本起始量不同，全基因組測序（WGS）DNA起始量2~5 ug，全外顯子測序（WES）和靶向測序均為1~2 ug，其中靶向測序是目前臨床開展較為常見的測序方法。

「最新的NGS技術不僅能夠定性，還能定量，這將大大有利於臨床決策的制定，但對檢測結果的準確性也提出了更高的要求。」郭凌川教授強調，「從樣本到出具報告的每個環節都需要進行質控，其中包括樣本DNA/RNA質控、DNA文庫質控等，只有經過嚴謹的質控才能確保報告結果的準確性。」

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