科研實驗 | 螢光共振能量轉移

2021-01-16 科儀堂


    螢光共振能量轉移技術，是採用物理方法去檢測分子間的相互作用的方法，適用於在細胞正常的生理條件下，驗證已知分子間是否存在相互作用。


    螢光共振能量轉移是指兩個螢光發色基團在足夠靠近時，當供體分子吸收一定頻率的光子後被激發到更高的電子能態，在該電子回到基態前，通過偶極子相互作用，實現了能量向鄰近的受體分子轉移（即發生能量共振轉移）。


    應用原理：將要檢測的蛋白（如圖 X 和 Y），分別偶聯上 ECFP 和 EGFP 螢光蛋白，ECFP和 EGFP 是一對螢光物質，我們稱之為供體（donor）和受體（acceptor）。當用 433nm 的紫光去激發 X 融合蛋白時，它能夠產生 475nm 的青色螢光；同樣，當我們用 475nm 的藍光去激發 Y 融合蛋白時，它能夠產生 507nm 的綠色螢光。


    當蛋白 X 和 Y 間沒有相互作用時（兩者的空間距離>10nm），融合蛋白 X 和 Y 分別產生相應的螢光而被檢測到，如果蛋白 X 和 Y 間存在相互作用（兩者的空間距離需<10nm），用紫光激發融合蛋白 X 其產生的青光會被融合蛋白 Y 吸收，從而產生綠色螢光，這時，在

細胞內將檢測不到青色螢光的存在。這時因為能量從 X 融合蛋白轉移到了 Y 融合蛋白，這就是螢光共振能量轉移技術。



    較為常用的供體-受體分子對，主要有綠色螢光蛋白類（GFPs）和染料類。綠色螢光蛋白類有 CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP 等，染料類的有 Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine 等。


    將供體-受體分子對分別標記在不同的分子上，可以研究蛋白-蛋白、RNA-RNA、蛋白-RNA、蛋白-DNA、DNA-DNA 等相互作用，本文以蛋白-蛋白相互作用為例。



    活細胞內檢測蛋白 A 和蛋白 B 的相互作用；



    1. 主要試劑 


    CFP-A 基因和 YFP-B 基因質粒等。


    2. 主要試劑 


    多光子共聚焦顯微鏡等。



    1.實驗所用細胞的培養；


    2. 細胞轉染質粒：構建質粒載體 CFP-A 和 YFP-B，將 A、B 蛋白分別偶聯上螢光蛋白 CFP 和 YFP，並將兩個質粒共轉染到培養的細胞內；


    3. 多光子共聚焦顯微鏡和 FRET 觀察；


    4. 標定 CFP（供體）和 YFP（受體），調整雷射變化，以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP信號的激發光波長，以此激發（CFP-YFP）雙表達細胞，選擇合適的濾鏡組合和高靈敏的 PMT，採集供體和受體圖像，收集 FRET 信號，調整供體雷射強度，固定用於激發供體，對受體激發波長也類似要求，注意調整能量，使用合適的中性密度濾光片，避免光漂白。每個細胞 FRET 檢測重複 3 次，每種轉染至少完成 6 個細胞的 FRET 檢測； 


    5. FRET 數據處理：去除 FRET 信號 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號；受體通路的 FRET 信號需要對供體受體光譜靈敏度的變化進行矯正、對自發螢光和光學噪聲進行矯正；利用矯正係數對雙標定細胞進行象素匹配矯正。



    1. Kopp MC, Nowak PR, Larburu N, Adams CJ, Ali MM. In vitro FRET analysis of IRE1 and BiP association and dissociation upon endoplasmic reticulum stress. Elife 2018; 7.


    2. Dolde C, Bischof J, Gruter S, et al. A CK1 FRET biosensor reveals that DDX3X is an essential activator of CK1epsilon. J Cell Sci 2018; 131(1).

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