近幾十年來，ICC的發病率在全球範圍內呈上升趨勢，其病因和發病機制尚不完全清楚。
肝內膽管癌（Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二常見的肝臟惡性腫瘤，與西方相比，東方世界部分地區的發病率要高得多。近幾十年來，ICC的發病率在全球範圍內呈上升趨勢，其病因和發病機制尚不完全清楚。因為其生物侵襲性、較差的可切除性以及目前有限的治療方法，ICC患者生存率低。目前，大約50%的病例仍然沒有任何可識別的危險因素去診斷。
EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）與多種呼吸道/消化道腫瘤有關，特別是未分化鼻咽癌（Undifferentialnasopharyngeal carcinoma，NPC）和EBV相關胃癌（EBVaGC），但EBV感染與ICC發病的關係尚不清楚。
目前關於EBV相關ICC(EBVaICC)的證據水平僅基於病例報告和小本報導。值得注意的是，以前報告的絕大多數EBVaICC病例發生在亞洲，具有中國血統，顯示出顯著的種族和地理分布特性。到目前為止，對EBVaICC知之甚少，合適的治療方案仍然未知。因此，需要系統和深入的了解，以進一步闡明這一罕見的實體瘤，並提供對於發病機制和治療策略有價值的見解。
因此，研究者旨在全面調查中國南方臨床病理特徵，腫瘤免疫微環境(TIME)和基因組景觀。採用EBV原位雜交技術對303例ICCs進行檢測，比較EBVaICC與nonEBVaICC的臨床病理參數，並採用免疫組化，雙重染色，巢式PCR，多重免疫螢光染色，螢光原位雜交和全外顯子組測序等方法分析EBV感染情況，腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）和EBVaICC的基因組特徵。
並首次報導了一例生存期長達84個月的EBVaICC患者，該患者對包括ICIs在內的綜合治療顯示出顯著的應答。此外，還首次揭示了來自該腫瘤的EBVaICC和EBV的基因組景觀。
Highlights：
EBVaICC佔ICCs的6.6%，以EBV潛伏I型和克隆型EBV分離株形式。
EBVaICC具有獨特的病因學，臨床病理學和分子遺傳學特徵。
在EBVaICC中，腫瘤浸潤淋巴細胞中PD-1和PD-L1以及腫瘤細胞中PD-L1均過表達。
大多數EBVaICC屬於TMIT I型，矛盾的是，患者對ICIs可能呈現良好的應答
EBVaICC的LEL亞型與良好的生存率有關，可能與腫瘤浸潤的B細胞和CD8+T細胞免疫激活有關。
該研究屬於回顧性研究，納入了303例ICC患者，這些患者於2008年4月至2017年5月期間在中國廣州中山大學腫瘤中心進行了首次手術切除。存活患者的中位隨訪期為50個月。
在原發性ICCs中檢測到6.6%（20/303）患者具有EBERs表達，而在其他類型的ICCs中均未觀察到EBERs，如肝門周圍膽管癌（pCCA），遠端膽管癌（dCCA），混合性肝細胞和膽管癌（cHCC-CCA）和肝細胞癌(HCC)。通過雙重染色顯示僅在EBVaICC腫瘤細胞中檢測到EBV，而所有EBVaICCs對EBNA1呈陽性，但對LMP1和EBNA2呈陰性，這表明EBV屬於潛伏I型感染。並通過巢式PCR在所有20個EBVaICC中檢測出克隆性EBV分離株。
EBVaICC患者年齡24～68歲，中位年齡46.5歲。女性佔優勢，男女比例為1:3。所有患者均為中國人。10例患者（50%）顯示HBsAg血清反應陽性，僅1例患者（5%）有組織學證實的肝硬化。19例（95%）患者存在孤立性腫瘤。根據AJCC TNM分期（第8版），14例（70%）患者分為I/II期，6例（30%）患者分為III/IV期。15例可用病例中有2例（13.3%）血清EBV DNA>1000拷貝/毫升。
EBVaICC的病理資料，包括組織學，免疫組化和原位雜交。組織學上，淋巴上皮瘤樣(LEL)亞型和常規型(CT)ICC在EBVaICC中分別佔比45%（9/20）和55%（11/20）。在所有LEL亞型EBVaICC的病例中腫瘤內均發現次級淋巴濾泡，但在任何EBVaICC CTs中均未發現次級淋巴濾泡。所有EBVaICC顯示膽汁型細胞角蛋白(CK7和CK19)的可變表達，並且顯示微衛星不穩定性錯義修復蛋白(MLH1，PMS2，MSH2和MSH6)的免疫陽性。
除HBV外，EBV感染與ICC的任何已知危險因素均無顯著相關。與nonEBVaICC患者相比，EBVaICC主要發生於女性（75.0%對37.8%），年輕患者（中位年齡46.5對57.0歲），HBsAg陽性率較高（50.0%對26.1%），肝硬化背景較低（5.0%對27.2%），膽石症/膽總管結石率較低（0%對16.8%），孤立腫瘤（95.0%對70.7%）和血清CA19-9水平較低（30.0%對58.0%）（p值均<0.05)。組織學上，ICC的LEL亞型在EBVaICC中顯著高於nonEBVaICC（45%對0.7%，P<0.001)，表明LEL亞型與EBV感染有密切關係。
儘管EBV感染與ICC中OS和RFS無顯著相關，但EBVaICC（LEL亞型）的2年OS率（89%）明顯優於EBVaICC(CT)(36%)和nonEBVaICC(38%)(P=0.028)。EBVaICC（LEL亞型）的2年RFS率為67%，高於EBVaICC(CT)和nonEBVaICC的分別為27%和30%(P=0.074)，但無顯著差異。值得注意的是，EBVaICC的2年OS和RFS率明顯優於HBVaICC和LFaICC。
EBVaICC TIL以CD3+T細胞 (84.4%±3.6%)，CD20+B細胞 (9.4%±2.8%)和CD68+TAM(6.1%±1.1%)為主。在T細胞群中，CD8+T細胞佔71.4%±2.9%，Foxp3+T細胞佔15.0%±2.0%，CTLA-4+T細胞佔13.6%±1.9%。在EBVaICC中，HLA-DR+M1 TAM(77.6%±2.9%)明顯高於CD163+M2 TAMs (22.4%±2.9%)。與nonEBVaICC相比，EBVaICC中CD20+B細胞和CD8+T細胞群體的比例顯著增加，而M1/M2 TAMs比例沒有發現差異。
與nonEBVaICC相比，EBVaICC中腫瘤浸潤免疫細胞的密度顯著增加，包括CD20+B細胞，CD3+T細胞，CD68+TAM，CD8+T細胞，FOXP3+T細胞，CTLA-4+T細胞，HLA-DR+M1 TAM和CD163+M2 TAM（所有p值均<0.01)。值得注意的是，EBVaICC的腫瘤免疫微環境明顯比HBVaICC和LFaICC更豐富。
與EBVaICC CT和nonEBVaICC比較，EBVaICC LEL亞型具有明顯高密度的CD20+B細胞，CD3+T細胞和CD8+T細胞（P均<0.05)。值得注意的是，CD20+B細胞和CD8+T細胞密度的增加分別與ICC中較長的OS和RFS顯著相關（所有比較均P<0.05)
EBVaICC中顯著過表達PD-L1-TIL，PD-L1-Tumor和PD-1-TIL。95.0%（19/20）EBVaICCs的腫瘤PDL1陽性（IRS評分≥3)，而僅22.3%（63/283）nonEBVaICCs 的腫瘤PDL1陽性（IRS評分≥3) (P<0.0001)；PDL1-TILs在EBVaICCs中的陽性率為100%（20/20）（IRS評分≥1)，而在nonEBVaICCs中的陽性率僅為56.5%（160/283）（P<0.0001）。
共有95.0%（19/20）的EBVaICCs的PD1-TILs陽性（IRS評分≥1)，而nonEBVaICCs的PD1-TILs陽性率僅為64.0%（181/283）(P=0.005)。有趣的是，通過FISH分析，95%（19/20）的EBVaICCs中未觀察到PD-L1基因擴增。
研究者根據免疫組化將每個ICC樣本分為TMIT四種類型（Ⅰ型(PD-L1+/CD8-high），Ⅱ型(PD-L1-/CD8-low），Ⅲ型(PD-L1+/CD8-low）和Ⅳ型(PD-L1-/CD8-high）。結果：Ⅰ型53例（17.5%）；Ⅱ型123例（40.6%）；Ⅲ型29例（9.6%）；Ⅳ型98例（32.3%）。TMIT與ICC中OS顯著相關(P=0.014)，但對於RFS不顯著(P=0.059)。
TMIT I亞組生存獲益最好，TMIT III亞組生存獲益最差。值得注意的是，EBVaICC與TMIT I顯著相關，因為90%（18/20）的EBVaICC屬於TMIT I，而nonEBVaICC僅為12.4%（35/283）(P<0.0001)。來自病例4號的患者對包括ICIs治療在內的聯合治療顯示出顯著的反應，生存期長至84個月。有趣的是，與HBVaICC和LFaICC相比，EBVaICC具有顯著不同的TMIT（除了具有顯著升高的TIL和具有高的PD-L1表達之外）。
研究者進一步分析了10個平均復蓋率為100×的EBVaICCs的WES數據，鑑定出3353個體細胞同義和非同義突變（包括單核苷酸突變和小插入和缺失，或InDels）。體細胞突變包括1346個非沉默突變和2007個沉默突變，這揭示了高突變率（中位數:每兆酶4.4個突變）。我們發現7個基因是至少在三個患者中受到非沉默突變的影響，包括MUC4，DNAH1，GLI2，LIPE，MYH7，RP11-766F14.2和WDR36。
體細胞突變類型以C:G>T:A和C:G>A:T為主。然後，鑑定出三個獨立且穩定的突變標記。另外，用MuSigCV軟體預測了22個潛在的EBVaICC的驅動基因。值得注意的是，EBVaICC顯示出與其它EBV相關癌包括EBVaGC，NPC和肺淋巴上皮瘤樣癌(LELC)和其它感染相關CCA（包括HBVaICC和LFaCCA不同的突變模式。
當分析具有從藥物基因相互作用資料庫彙編的信息的Maftools中的可用藥基因組的突變時，在三個病例（30%）中鑑定出PRSS1的缺失，PRSS1被認為是胰腺炎中的疾病原因。CD274的擴增與EBVAGC中PD-L1的表達增高有關，而CD274的擴增與EBVaGC中PD-L1的表達增高有關。用novoBreak算法檢測10例EBVaICC中用分離雙色探針進行FISH分析未發現FGFR2基因融合。
在ICC衍生的EBV中發現的前40個常見非同義突變。所有病例均有BKRF4(H171N)，BcRF1(T33A)，BKRF4(G169V)，BOLF1(D1154E)和BPLF1(S405G)等新的熱點，除BPLF1(S405G)因GC DNA模板過高而導致突變驗證失敗外，其餘的熱點均在腫瘤組織中被成功驗證。
值得注意的是，BOLF1和BRRF2的變異在ICC中顯著富集，而在EBNAs，LMP1，LMP2和BDLF2/3上的變異除外，這些變異在來源於其它癌症的EBV中一致報導。
然而，這項研究在某些方面是有限的。雖然納入了大量的ICC隊列，但EBVaICC和對照組（pCCA，dCCA和cHCC-CCA）的數量仍然較少，部分結果可能需要驗證。
此外，由於新鮮組織標本中RNA質量較差，整個轉錄組測序失敗。此外，根據我們的WES數據，沒有觀察到EBV基因組整合的可靠證據。未進行全基因組測序，EBV是否直接整合到宿主基因組中仍是未知的。
EBVaICC佔ICCs的6.6%，以EBV潛伏I型和克隆性EBV分離株形式。EBVaICC的獨特臨床病理特徵如下：女性多見及年輕患者多見，孤立性腫瘤，具有較高HBV感染率，少有肝硬化背景，增高的淋巴上皮瘤樣(LEL)亞型比例。
EBVaICC的腫瘤免疫微環境比nonEBVaICC更豐富。EBVaICC LEL亞型中CD20+B細胞和CD8+T細胞密度和比例明顯增高，與EBVaICC常規型和nonEBVaICC相比，LEL亞型與2年OS和RFS顯著相關。TIL中PD-1和PD-L1及腫瘤細胞中PD-L1在EBVaICC中均過表達。腫瘤環境免疫類型I型(TMIT) (PD-L1-Tumor+/CD8-high)在EBVaICC中明顯高於nonEBVaICC。在至少三個病例中發現了突變基因，包括MUC4，DNAH1，GLI2，LIPE，MYH7，RP11-766F14.2和WDR36。EBVaICC與已報導的肝吸蟲相關膽管癌和HBVaICC相比具有不同的突變模式。
結論：ICC的亞分類EBVaICC具有獨特的病理學特徵、臨床病理學特徵和顯著增加的腫瘤免疫微環境的分子遺傳學特徵。大多數病例屬於TMIT I型。但自相矛盾的是，EBVaICC患者可能是免疫治療的候選者。