有效促進tau清除的全新分子機制

2020-10-27 brainnews

2020年4月，美國德克薩斯州休斯敦貝勒醫學院赫芬頓衰老中心Hui Zheng團隊在MOLECULAR PSYCHIATRY發表論文TFEB regulateslysosomal exocytosis of tau and its loss of function exacerbates tau pathologyand spreading，發現轉錄因子EB（TFEB）是溶酶體生物發生的主要調節因子，在tau蛋白的溶酶體胞吐中起著重要作用，有益於AD的治療。

tau蛋白疾病包括額顳葉痴呆和最常見的阿爾茨海默症（AD），其特徵是細胞內神經原纖維纏結（NFT）的積累。迄今為止，大多數AD臨床試驗都針對清除Aβ沉積。但到目前為止，Aβ療法在臨床試驗中屢屢宣告失敗，一個可能的原因是Aβ療法需要在tau蛋白大量積累之前使用，以產生明確的治療效應。新皮層中的tau病理與認知下降的聯繫比Aβ聚積更加緊密，因此越來越多的研究開始著眼於開發AD和其他tau通路疾病的tau蛋白療法。

研究表明tau聚集體可以穿過細胞膜，隨後擴散到突觸連接區域的其他細胞中，導致細胞間轉移或阮病毒樣 tau病理學的傳播。已有文獻報導tau的微管結合重複（MTBR）區域內的序列對於成核至關重要，一些不溶的tau和可溶的單體或者聚集物tau中顯示出播種和傳播的特性，這種具有播種和傳播特性的tau都含有MTBR序列。從人類腦脊液、誘導的人類多能幹細胞（iPSC）衍生的神經元和小鼠神經元培養物中檢測到的tau在MTBR序列之前被截短，因此無法播種和聚集。這些發現提出了一個問題，即這些截短的tau在哪裡產生，它們是如何分泌的，功能是什麼？在這裡，本文提出，轉錄因子EB（TFEB）是溶酶體生物發生的主要調節因子，它對MTBR截短、tau的清除有很強的作用，其活性取決於TRPML1通道。

1，TFEB功能喪失可降低PS19小鼠腦組織間液（ISF）中的tau

由於TFEB已被證明通過自噬和溶酶體的胞吐促進細胞中病理tau和神經纖維纏結的清除，本研究希望探討除了自噬溶酶體途徑，TFEB是否還可以通過其他途徑調節tau的清除。因此，該團隊使用特異性敲除神經系統TFEB的小鼠（cKO）與PS19 tau轉基因小鼠雜交，發現TFEB-cKO對自身ISF-tau沒有影響，但是可以顯著降低PS19小鼠ISF-tau（圖1），然而TFEB cKO並不能降低PS19小鼠腦組織中tau。這些結果表明ISF中tau蛋白的變化主要是由TFEB介導的，而不是細胞內源tau蛋白改變的結果，TFEB在介導體內突變tau蛋白的釋放中發揮著生理作用。

圖1. TFEB功能喪失可降低PS19中的ISF tau，但不會降低野生型小鼠的ISF tau


2，體外實驗表明TFEB介導截短突變tau的釋放

該團隊進一步使用了兩種tau抗體：一種可以識別tau的中間結構域區域，但無法區分MTBR截短形式或含MTBR的形式（Tau5，aa 210-241）；另一種則特異性結合MTBR區域（K9JA，aa 243-441）。用含有P301L突變的人AAV-tau蛋白感染細胞，發現儘管ELISA檢測到的兩種細胞內tau水平相當，但K9JA/BT2 ELISA檢測的細胞外tau明顯低於中間結構域ELISA（Tau5/BT2）檢測的tau水平（圖2）。這一結果表明，TFEB介導了培養的原代神經元中MTBR截短tau蛋白的釋放，並可能在PS19小鼠的大腦中發揮作用。

為了評估tau截短是否在溶酶體內發生，該團隊通過檢測溶酶體中間結構域（Tau5/BT2）和MTBR區域（K9JA/BT2）水平，發現Tau5/BT2信號顯著高於K9JA/BT2，表明tau截短發生在溶酶體中。接下來，本文使用TFEB KO和TFEB家族成員（包括TFEB，MITF和TFE3） KO的HeLa細胞，探索了TFEB依賴性tau釋放的機制。qPCR分析顯示，與野生型HeLa細胞相比，經Torin1（一種mTOR抑制劑）處理後TFEB溶酶體基因mRNA水平降低，並促進了TFEB的核轉移和活化。

而後，該團隊將攜帶P301L突變的人tau基因轉染到這些細胞，發現與野生型HeLa對照組相比，TFEB-KO和TFEB家族成員KO（TKO）細胞外/細胞內tau比值顯著降低。將人P301L tau轉染到過表達TFEB的HeLa細胞中，然後測量培養基和細胞裂解物中的tau水平，結果表明TFEB 過表達可導致TFEB的溶酶體靶基因表達增加，細胞外/細胞內tau比值的顯著增加。而後，該團隊使用R406W突變tau額顳葉痴呆患者和對照的iPSCs神經元，發現Torin1處理誘導突變型tau的釋放，但不誘導野生型tau的釋放。

這些結果都表明了TFEB在生理或過表達條件下特異性介導突變體而非野生型tau蛋白釋放。

圖2. TFEB介導原代神經元截短突變tau的釋放



3，TFEB介導的tau釋放依賴於TRPML1

TRPML1是TFEB的靶標，可介導TFEB下遊的溶酶體胞吐作用。研究發現，過表達TRPML1對WT細胞中的細胞外tau蛋白水平沒有明顯影響，但是過表TRPML1在TKO細胞中的表達顯著上調了細胞外tau蛋白水平和細胞外/內tau蛋白比值，但對細胞內tau蛋白水平沒有明顯影響，說明TRPML1介導TFEB下遊的tau胞吐作用。

為了驗證TRPML1是否還介導tau在神經元中的釋放，該團隊使用TRPML1特異性抑制劑ML-SI1和YM201636處理表達P301L tau的神經元，結果觀察到tau釋放的顯著減少，而在TFEB-cKO細胞中tau釋放量則進一步降低。

4，TFEB功能喪失導致tau釋放減少與細胞內病理和擴散有關

為了研究TFEB-KO在病理性tau積聚中的功能作用，該團隊首先將rTg4510 tau轉基因小鼠的腦組織裂解物接種於AAVtau-P301L感染的神經元，誘導tau過度磷酸化和錯誤摺疊。與同窩對照組相比，TFEB cKO增加了錯誤摺疊的和磷酸化的tau蛋白數量（圖3）。結果表明在tau擴散模式下，TFEB介導的突變tau蛋白的胞吐與其在神經內的積累呈負相關。

對12月齡的PS19和PS19/TFEB-cKO小鼠檢測發現，TFEB cKO可以使磷酸化tau顯著增加。將rTg4510 tau轉基因小鼠的腦裂解液注射到2-3月齡的PS19或PS19/TFEB-cKO小鼠的一側海馬中，注射6周後，發現PS19小鼠的同側和對側海馬中均可檢測到錯誤摺疊的tau，而PS19/TFEB-cKO小鼠錯誤摺疊的tau顯著增加（圖3）。以上結果提示，PS19/TFEB-cKO小鼠中ISF tau的減少與磷酸化tau病理和擴散的增加有關。

圖3. TFEB cKO在體內和體外增強tau病理


5，總結與展望

本文證明了TFEB在介導體內突變tau蛋白的釋放中發揮著重要的生理作用，可顯著降低PS19小鼠的ISF tau，且TFEB介導了原代神經元中MTBR截斷tau蛋白的釋放，並可能在PS19小鼠的大腦中發揮作用；此外TFEB介導的tau釋放依賴於TRPML1，TFEB功能喪失會導致tau釋放減少。考慮到NFTs與AD臨床進展之間的相關性，針對有毒tau蛋白和NFTs的策略越來越被認為是有前景的治療方法，本文的發現對於細胞外和細胞內tau靶向均具有重要意義，揭示了TFEB在介導tau胞吐中的生理作用，並且闡述了該途徑有效促進tau清除的分子機制，有助於基於tau蛋白的AD治療方法的探索。


參考文獻：

Xu Y, Du S, Marsh JA, Horie K, Sato C, Ballabio A, Karch CM,Holtzman DM, Zheng H (2020). TFEBregulates lysosomal exocytosis of tau and its loss of function exacerbates taupathology and spreading. Mol Psychiatry.


編譯作者：胖兔子可可 (Brainnews創作團隊)

校審： 小言、Simon (Brainnews編輯部)

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