哈工大報訊（生命/文）近日，我校生命學院黃志偉教授課題組通過結構生物學和生化研究手段揭示了SpCas9變體（xCas9 3.7）識別底物的兼容性和高保真性的分子機制。該研究成果以《高保真SpCas9變體的結構基礎》（《Structural insights into a high fidelity variant of SpCas9》）為題發表在《細胞研究》（Cell Research）雜誌上。
CRISPR-Cas系統是細菌編碼的用以防禦噬菌體的適應性免疫系統。該系統通過RNA引導的效應蛋白剪切病毒的DNA或者RNA從而抵抗噬菌體（病毒）的感染，其中來自化膿性鏈球菌(SpCas9）與sgRNA組合具備在細胞或生物體內進行高效、便捷「編輯」目的基因的能力，所以近些年來CRISPR-Cas9系統及其衍生技術被迅速地應用於基因編輯。雖然，CRISPR-Cas9系統作為最廣泛使用的的基因編輯工具被應用於生物、醫學、農業領域的基因編輯，但該系統帶來的脫靶效應和對識別底物PAM的限制一直是亟待解決的問題。目前通過對SpCas9蛋白的篩選，產生了高保真的SpCas9突變體，比如xCas9 3.7(A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I、E1219V)，然而SpCas9突變體的高保真結構基礎一直未知。
為了揭示xCas9 3.7具有廣泛的PAM兼容性和高度DNA靶向特異性的分子機制，該團隊解析了xCas9 3.7、sgRNA與包含兩種不同PAM的雙鏈DNA的三元複合物的三維結構進行結構分析，發現E1219通過鹽橋穩定的R1335對SpCas9嚴格選擇PAM序列至關重要，xCas9 3.7中E1219V的突變解除了對R1335側鏈的限制，使其具有一定的自由度，從而增加了對其他底物PAM識別能力。
xCas9 3.7與野生型（WT）SpCas9相比，儘管兩者整體結構相似，但xCas9 3.7中的REC2和REC3結構域有顯著的構象變化，使得和DNA底物的接觸減少，增加了底物識別的特異性，從而降低了脫靶效應。基於這一研究發現的機理，該團隊理性設計了一系列SpCas9變體，在生化實驗和細胞實驗中顯示出新設計的突變體與野生型SpCas9相比，具有顯著提高的保真性。該研究不僅第一次揭示了高保真的Cas9基因編輯系統的分子機制，而且為改造SpCas9以及其他Cas核酸內切酶，使之成為更高效、更特異的基因編輯工具提供了關鍵結構基礎，具有指導改造新型基因編輯系統的應用價值。這也是該團隊在病原與宿主相互作用系統以及基因編輯系統領域取得的又一研究成果。
黃志偉教授為該論文的通訊作者，該團隊的博士研究生郭明慧、任寬和師資博士後朱玉威為該論文的並列第一作者。上海同步輻射中心為晶體數據收集提供了支持。本項目受到國家自然科學基金委、哈工大青年科學家工作室等基金的資助。
文章連結：https://www.nature.com/articles/s41422-018-0131-6