Nature Nanotech.:八面玲瓏納米疫苗,腫瘤無處逃!

近日，來自美國德克薩斯大學西南醫學中心的高金明（Jinming Gao）教授和美國國家科學院院士陳志堅（Zhijian J. Chen）教授等人發現，一種由酸度響應聚合物組成的納米顆粒（PC7A）與抗原組成的簡單複合物不僅可以有效促進抗原在抗原遞呈細胞中的胞質輸送、顯著增強抗原呈遞，還可以通過激活Ⅰ型幹擾素刺激因子（STING）刺激產生Ⅰ型幹擾素，從而顯著增強該納米疫苗的抗癌效應。相關工作發表於Nature Nanotechnology 上，共同第一作者為Min Luo博士、Hua Wang博士和Zhaohui Wang博士。

本文部分作者（從左至右）：Min Luo博士、高金明教授、陳志堅教授、Zhaohui Wang博士、Hua Wang博士。圖片來源：University of Texas Southwestern Medical Center

高金明教授課題組早期致力於腫瘤早期診斷磁共振納米探針的開發，近幾年則致力於腫瘤微環境響應性診斷探針的開發與轉化。該課題組此前曾開發出了一系列基於聚乙二醇-聚甲基丙烯酸酯、對生理環境pH（4-7.4）高度敏感的pH超敏納米顆粒，已經成功用於腫瘤微環境診斷（Nat. Mater., 2014, 13, 204-212）及手術指導。考慮到該類納米顆粒尺寸僅為20-50 nm，同時可以在特定pH條件下發揮質子海綿效應，破壞細胞膜，促進物質的胞質運輸，他們推測這些納米顆粒可能具有促進抗原胞質輸送及運輸至淋巴結的能力。因此他們先在小鼠體內評估了這些納米顆粒產生細胞毒性T淋巴細胞（CTL）反應的能力。

他們使用卵清蛋白（OVA）為模式抗原，將之與納米顆粒複合形成納米疫苗並皮下注射到小鼠體內，然後通過體內CTL試驗檢測OVA特異性的CTL反應，發現納米疫苗OVA-PC7A介導的OVA特異性脾臟細胞殺傷率最高（達82%），其殺傷效率是相同pH值響應的OVA-PC6S1A和OVA-PEPA的兩倍，而線性氨聚合物中，OVA-PEPA產生的CTL反應最強，這表明聚合物結構和響應性pH值都對納米疫苗產生的CTL強度有影響。同時，OVA-PC7A產生的CTL反應強度是OVA-alum或者OVA-LPS（均激活toll樣受體4（TLR4）通路）的20倍，是OVA-CpG（激活TLR9通路）的3.6倍。此外它還可以產生OVA特異性的IgG1和IgG2c抗體，這意味著基於PC7A的納米疫苗可以誘導產生強烈的抗原特異性CTL反應、Th1和Th2反應，效果甚至優於現有的成熟佐劑-抗原組合。

圖1. 基於PC7A的納米疫苗可以產生強烈的抗原特異性CTL反應、Th1和Th2反應。圖片來源：Nature Nanotech.

為了示蹤納米顆粒在體內的運動，作者採用吲哚菁綠標記了PC7A納米顆粒，在小鼠尾基部注射後採用活體成像研究了納米顆粒的體內分布。他們發現納米顆粒在注射後24小時可以到達外周淋巴結，而基本不分布到其他器官。通過使用螢光分子標記的OVA並採用流式細胞術分析淋巴結中OVA陽性的巨噬細胞和樹突狀細胞（DC），作者發現PC7A介導的OVA在所有細胞中的分布均多於游離的OVA。與游離OVA相比，OVA-PC7A使OVA陽性的CD8α⁺DC的數量增加了29倍，而該細胞對誘導CTL反應至關重要。進一步研究發現儘管骨髓來源樹突狀細胞（BMDC）對OVA-PC7A和OVA-PD5A的攝取能力相當（均高於游離的OVA），但是PC7A誘導的抗原呈遞數量比其他兩組高3倍，PC7A處理後的BMDC可以促使OT-I小鼠來源的CD8⁺T細胞產生IFN-γ的量明顯增加，OVA-PC7A在體內刺激產生OVA特異性的CD8⁺T細胞的數量也比其他兩組高15倍。這些結果表明PC7A可以顯著增強抗原在APC中的胞質輸送和抗原呈遞，從而顯著增強產生的抗原特異性T細胞的量。

圖2. PC7A納米顆粒增強APC中的抗原胞質輸送和抗原交叉呈遞並刺激CD8 T細胞反應。圖片來源：Nature Nanotech.

由於共刺激信號（CD80/86）和細胞因子也是誘導強烈腫瘤特異性CTL反應的必要因素，因此作者檢測了納米疫苗對APC共刺激分子表達和細胞因子分泌的影響。採用納米疫苗免疫後24小時，取小鼠的腹股溝淋巴結進行分析，發現OVA-PC7A刺激後各種APC表面CD86的表達量均高於對照組，同時IFN刺激基因（包括IRF7和CXCL10）的表達量也有所增加。和Poly(I:C)（陽性對照）及OVA-PD5A相比，OVA-PC7A在免疫後24小時誘導產生的免疫反應更強。通過在一系列基因缺陷小鼠體內進行相同實驗，作者發現OVA-PC7A誘導的免疫反應並非依賴於TLR及線粒體抗病毒信號蛋白通路（MAVS），而是依賴於STING通路（註：TLR、MAVS和STING通路是APC中介導抗癌免疫反應的三個重要細胞信號通路），可能原因是PC7A直接和STING相互作用而激活STING。在這個過程中，APC（尤其是DC）是吞噬OVA-PC7A的主要細胞亞群，隨後細胞內的STING-I型IFN信號通路被激活，從而增強了該納米疫苗抗癌免疫反應。儘管作者認為還需要進一步實驗確認PC7A激活STING的機制，但是並未在本文進行深入研究。

圖3. PC7A納米顆粒激活引流淋巴結中的APC並刺激依賴STING的適應性免疫反應。圖片來源：Nature Nanotech.

基於以上實驗結果，作者採用幾種腫瘤模型驗證了該疫苗的抗癌療效。在B16-OVA黑素瘤模型中，OVA-PC7A疫苗療效最佳，植瘤40天後還有50%的小鼠存活，而單獨的抗原組或者OVA-PD5A組的小鼠在20天左右就全部死亡。在B16-F10黑素瘤和直腸癌MC38模型中，抗原-PC7A疫苗組療效均優於其他對照組。而在人乳頭狀瘤病毒（HPV）E6/7 TC-1腫瘤模型中，抗原-PC7A疫苗可以使50%的小鼠在植瘤後60天的時間裡保持無腫瘤狀態。而將抗原-PC7A與抗PD-1抗體聯合使用時，植TC-1腫瘤的小鼠在60天後全部存活，有90%的小鼠無腫瘤。同時，組織學分析發現PC7A納米疫苗治療的小鼠各器官未觀察到明顯的毒性。總體而言，該納米疫苗可以在抗原用量較低（0.5 µg）的條件下產生較強烈而安全的抗腫瘤免疫反應，同時與免疫檢驗點抑制劑具有協同抗癌效應。

圖4. PC7A納米疫苗可以有效治療各種腫瘤，同時與免疫檢驗點抑制劑具有協同抗癌效應。圖片來源：Nature Nanotech.

——總結——

本文介紹了一種具有佐劑效應的新型疫苗，尺寸效應促進其淋巴結富集，而pH響應性促進抗原的胞質輸送及交叉呈遞。同時，研究人員發現PC7A具有結合STING的效應，因而該納米疫苗具有較強的抗癌效應。

咋一看，能發現這樣一個現象實屬運氣，但是事實上能夠把這項研究做到發Nature Nanotechnology 的水平確實不能全靠運氣。高金明教授實驗室擁有一系列性質優良的聚合物，促使他們有機會發現PC7A具有促內涵體逃逸、促抗原呈遞效應以及STING激活效應，這說明研究積累很重要；其次，高金明教授與陳志堅教授同在一個單位，恰巧後者是cGAP-STING信號通路研究大咖，每年均有2、3篇CNS文章到手，本文關於PC7A激活STING的機理研究算是手到擒來，這說明優秀的合作夥伴也非常重要。這一工作可謂是「天時地利人和」的結果。（不多說了，回去合成聚合物去了。另外，優秀的合作夥伴們，快到碗裡來吧！在下這裡有很多聚合物~~）