前言
2020 年 5 月 20 日，湖南大學於峰教授和中南林業科技大學林親錄教授作為共同通訊作者，在 Science Advances雜誌（IF: 12.804）在線發表了題為「RALF1-FERONIA complex affects splicing dynamics to modulate stress responses and growth in plants 」的研究論文，深入探究了擬南芥響應細胞外信號進而調控 mRNA 可變剪接的機制。文章中轉錄組測序及可變剪接分析由歐易生物完成。
研究背景
真核生物基因的可變剪接（AS），豐富了基因的編碼能力和轉錄調控潛能。植物針對體外信號做出響應，以動態調控基因的可變剪接。擬南芥受體蛋白激酶 FERONIA 可以響應其配體 RALF1 小肽信號，調控植物的生長、脅迫響應，影響作物的糧食產量和品質，但 FERONIA 如何響應 RALF1 信號以調控如此多樣的細胞內活動仍有待深入研究。本研究從基因可變剪接的角度進行了探究。
研究內容
本研究在擬南芥中通過轉錄組測序進行可變剪接分析，結果表明細胞外信號 RALF1 可以通過其受體 FER 與 GRP7 蛋白互作並調控 GRP7 磷酸化，進而促進 GRP7 蛋白在細胞核內積累。FER 依賴的 GRP7 磷酸化促進了其與 mRNA 的結合能力、與剪接複合體成員 U1 的結合，最終動態調控 mRNA 的可變剪接。GRP7 自身的可變剪接，通過 NMD 機制負反饋調控 RALF1-FER-GRP7，精細調控對脅迫的響應與細胞生長。RALF1-FER-GRP7 為植物響應外部刺激引起的 mRNA 剪接調控機制提供了一個範式。
研究結果
1. RALF1 調控擬南芥根中基因的可變剪接
利用 RALF1 處理擬南芥 Col-0 的根，進行轉錄組測序。結果顯示，與空白處理對照相比，RALF1 處理後對根中 mRNA 表達量的影響較小，但顯著影響了 mRNA 的可變剪接（AS）。共檢測到 3401 個顯著差異的 AS 事件（左上圖），GO 分析表明發生 AS 改變的基因主要參與 DNA 修復、胺基酸合成、脅迫響應、根細胞分化等過程（左下圖）。隨機選擇其中 20 個 AS，，其中 16 個可以利用 semi-PCR 得以驗證（右圖）。
接下來，為了證明 RALF1 是否通過剪接複合體影響了 AS，分別在剪接複合體突變的 sr45-1 和 lsm8-1、以及 RALF1 受體突變的 fer-4 中進行了檢測，結果顯示這些突變體中 RALF1 導致的根生長抑制現象均出現一定程度的緩解（下圖）。同時實驗證實 RALF23 可以起到與 RALF1 類似的根生長抑制作用。
2. FER 與 GRP7 蛋白相互作用
在 RALF1 受體突變體 fer-4 中，對上述受到 RALF1 調控的 AS 進行檢測，均顯示 AS 的改變不顯著，這表明 RALF1 通過其受體 FER 調控可變剪接。酵母雙雜交篩選、GST pull-down 和 BiFC 實驗表明，FER 可以與 GRP7 蛋白直接相互作用（下圖）。
3. RALF1 通過 FER 調控 GRP7 的磷酸化水平
利用 ABA 誘導的體外磷酸化系統檢測顯示，FER 可以介導 GRP7 的 6 個胺基酸殘基發生磷酸化。GRP7 的磷酸化水平隨 RALF1 處理而升高，但在 fer-4 突變體中 GRP7 磷酸化不受 RALF1 影響（下圖 B）。同時利用 label-free 檢測顯示 RALF1 在體內主要影響了 GRP7 Ser132 和 Ser139 位點的磷酸化（下圖 C-D）。
4. RALF1-FER 通過 GRP7 調控可變剪接
為了研究 GRP7 是否參與了 RALF1 介導的 AS 改變，對 Col-0、fer-4 以及 grp7-1 8i 進行了轉錄組測序，其中 grp7-1 8i 是一個帶有 GRP8 RNAi 載體的 grp7-1 T-DNA 插入突變體。與 Col-0 對照相比，fer-4 中共篩選到 3509 個顯著的 AS 事件，grp7-1 8i 中共篩選到 3822 個顯著的 AS 事件，有 1164 個 AS 事件同時存在於兩組差異結果中，並且兩組比較間大部分 AS 差異的趨勢相同（下圖）。GO 富集分析顯示兩組共同差異的 AS 主要參與脅迫響應和發育。12 個 AS 中的 11 個可以通過 semi-PCR 得以驗證。
同時分析顯示，FER、GRP7 突變體中與 RALF1 處理所引起的 Col-0 中 AS 高度一致，表明 RALF1 所引起的 AS 改變部分通過 FER 和 GRP7 來實現。
5. RALF1-FER 通過 FER 介導的 GRP7 磷酸化調控可變剪接
RALF1 處理會抑制植物的根長，而在 fer-4 和 grp7-1 8i 突變體中，對 RALF1 引起的根長抑制變得不敏感。grp7-1 8i 中過表達 GRP7 後能夠恢復根長對 RALF1 的響應。在 grp7-1 8i 突變體背景下過表達磷酸化失活突變的 GRP7mut6A，不能夠恢復根長對 RALF1 的響應；而在 grp7-1 8i 突變體中過表達磷酸化激活的 GRP7mut6A ，根長相比對照而言對 RALF1 更為敏感（圖 D），這表明 FER 介導的 GRP7 磷酸化在 RALF1 響應中至為關鍵，活性氧反應（圖 E）同時驗證了上述結論（圖 F）。ABA 處理（圖 G）也表明，GRP7 和 FER 參與調控植物的脅迫響應，而這一過程同樣依賴於 GRP7 的磷酸化。
亞細胞定位顯示，RALF1 處理會導致 Col-0 中 GRP7 在細胞核積累（圖 A-B），而 RALF1 處理的 fer-4 突變體中 GRP7 在細胞核積累不顯著。同樣，無論是否經 RALF1 處理，磷酸化位點失活突變的 GRP7mut6A 擬南芥中 GRP7 也較少分布於細胞核中。這表明 RALF1-FER 途徑促進了 GRP7 在細胞核中的積累，並且這一過程部分依賴於 FER 介導的磷酸化。酵母雙雜交與 BiFC 實驗表明，GRP7 可以在細胞核中與剪接複合體的成員 U1 互作（圖 C-D）。
EMSA 實驗檢測表明，GRP7 可以結合到 PUB9、ABF1、LRK10L1.1 mRNA，這些基因都是 ABA 相關基因並且都具有 GRP7 結合 motif。磷酸化的 GRP7 與 mRNA 的結合能力更強（上圖 F）。RIP 實驗也證實，GRP7 在體內也具有與 mRNA 結合能力，但在 fer-4 突變體中結合能力較弱，RALF1 處理可以增強 GRP7 與 mRNA 的結合（上圖 G）。以上結果說明 RALF1 通過促進 FER 介導的 GRP7 磷酸化介導了 GRP7 與 mRNA 的結合能力。
6. RALF1-FER-GRP7 調控的可變剪接的作用
為了研究 RALF1-FER-GRP7 介導的可變剪接的作用，選擇 ABA 信號途徑中的轉錄因子 ABF1 為研究目標。前述轉錄組測序數據顯示 ABF1 有兩個轉錄本，其中 ABF1.1 編碼 392 個胺基酸，ABF1.2 編碼 403 個胺基酸。在 fer-4 和 grp7-1 8i 突變體中，ABF1.1 表達量上升，而ABF1.2 表達量下降，說明 FER 和 GRP7 影響了 ABF 的可變剪接。與對照相比，在 wt 中過表達 ABF1.2 會使擬南芥呈現 ABA 抗性，而過表達 ABF1.1 會使擬南芥對 ABA 更為敏感（圖 C-D）。說明 RALF1-FER-GRP7 調控的可變剪接影響對 ABA 的應答。
7. GRP7 AS 轉錄本表達水平受到 NMD 機制調控
無義介導的 mRNA 降解（nonsense-mediated mRNA decay, NMD）作為真核生物體內的重要調控機制，可以介導可變剪接產生的錯義轉錄本降解。GRP7 也可以通過 NMD 機制進行調控。GRP7 有一個保留了部分內含子的可變轉錄本 as_GRP7，會導致 GRP7 翻譯的提前終止，無法產生有功能的蛋白，最終被 NMD 機制降解。Semi-PCR 顯示，相比對照，as_GRP7 在過表達突變型 GRP7mut6D 和野生型 GRP7 中表達水平升高，而在過表達 GRP7mut6A 突變型中表達水平降低，表明 GRP7 的過磷酸化會觸發 as_GRP7 產生，而 as_GRP7 有可能會對 GRP7 的蛋白產生負反饋調控。ABA 處理後，GRP7 蛋白水平會顯著降低，究其原因發現 ABA 處理後雖然 GRP7 RNA 水平總體上升（圖 B），但是 as_GRP7 上升顯著，導致 mRNA 降解，引起了蛋白水平的下降（圖 C）。由此可以推斷 ABA 同樣可以通過 NMD 機制動態調控了 GRP7 的表達水平。
研究結論
基於以上結果，本研究提出了擬南芥響應細胞外信號調控 mRNA剪接的作用機制：細胞外信號 RALF1 通過其受體 FER，與 GRP7 結合併介導其磷酸化，磷酸化的 GRP7 在細胞核內積累並與可變剪接複合體結合調控了 mRNA 的可變剪接。而 GRP7 自身也由於發生可變剪接受到 NMD 機制的調控以維持動態平衡，精細調控植物對脅迫的響應。
· 作者簡介
林親錄，中南林業科技大學食品學院院長，二級教授，樹人學者特聘教授；稻穀及副產物深加工國家工程實驗室主任；中組部萬人計劃人才，國家重點領域「大米深加工與綜合利用」創新團隊首席專家，課題組近年來聯合湖南大學圍繞水稻逆境及品質調控研究發表論文多篇。
於峰，湖南大學生物學院教授，博士生導師，副院長，青年長江學者。課題組長期圍繞植物環境適宜性機制開展深入研究，該課題組近兩年來相繼在 PLOS Biology（點擊連結查看詳情）、Molecular Plant、New Phytologist 等期刊上發表論文多篇。
汪龍，湖南大學首屆傑出博士後，博士畢業於中南林業科技大學（導師：林親錄），2018年7月進入湖南大學生物學院開展博士後訓練（合作導師：於峰）。以第一作者/並列第一作者在Science Advances, Journal of Experimental Botany等發表論文7篇，授權專利4項。主持中國博士後基金面上項目1項。
參考文獻
Wang L, Yang T, Wang B, et al. RALF1-FERONIA complex affects splicing dynamics to modulate stress responses and growth in plants. Sci Adv 2020; 6(21): eaaz1622.
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鄭小辮兒 撰文
本文系歐易生物原創
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