10月12日，國際學術期刊Nature Communications 在線發表了中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所國家蛋白質科學中心（上海）吳立剛研究組的最新研究成果：Ribozyme-enhanced single-stranded Ago2-processed interfering RNA triggers efficient gene silencing with fewer off-target effects，該成果發明了一種較傳統shRNA（short hairpin RNA）更為安全的高效RNA幹擾（RNAi）載體——saiRNA。
RNAi是由siRNA介導的特異性降解具有互補序列的RNA，從而在轉錄後水平沉默靶基因表達的現象。RNAi在真核生物進化中高度保守，目前已被廣泛應用於基因功能的研究，並可開發成為小核酸藥物直接用於疾病治療，近期已有幾十種siRNA藥物進入一期或二期臨床試驗，有望成為續小分子化合物和蛋白質（抗體）藥物後的另一類新型的藥物，具有很大的應用潛力。RNAi發揮基因沉默功能的核心成分是RISC複合物，主要由外源提供的siRNA與細胞內的Ago家族蛋白質組裝形成。在哺乳動物中，外源siRNA主要通過兩種方式獲得：一種是通過化學方法直接合成雙鏈siRNA分子，通過轉染進入細胞質內與Ago蛋白結合併沉默靶基因。但化學合成siRNA的成本較高，在細胞或動物體內容易被代謝（如核酸酶）清除，作用持續時間較短，且一些類型的原代細胞難以被高效轉染，因此在應用上具有一定的局限性。另一種獲得siRNA的方式是通過DNA載體，利用細胞內源的RNA聚合酶Ⅲ（RNA PolⅢ），如U6、H1等的啟動子驅動轉錄表達shRNA，轉錄產生的髮夾狀shRNA可以被細胞內源的Dicer蛋白識別並加工成siRNA，然後與Ago蛋白結合發揮作用。shRNA的表達框不僅可以構建在質粒載體上直接轉染細胞進行瞬間基因沉默，還可以構建成慢病毒（lentivirus）載體，能感染大多數種類的宿主細胞並長期沉默靶基因，在高通量的功能基因篩選中有廣泛的應用；如果將shRNA構建在腺病毒（ADV）和腺相關病毒（AAV）載體上，可以實現在動物整體或特定組織中沉默靶基因。
任何一種技術都有其優點和缺陷，RNAi技術也不例外。隨著其廣泛應用，RNAi的毒副作用逐漸被認識和報導，其來源主要包括兩大類：（1）脫靶作用（off-target）。由於siRNA不僅可以通過完全互補配對的方式切割靶標RNA，還可以通過與RNA部分互補配對，以類似miRNA（microRNA）的作用方式（即2-7位seed region的鹼基配對）非特異性抑制靶基因以外其它基因的表達。（2）對細胞內源miRNA的競爭抑制。由於shRNA的加工需要細胞內的Dicer、Exportin-5、Ago等蛋白質因子協助，而這些蛋白質因子也是細胞內源miRNA加工成熟所必須的。由於miRNA是細胞功能的重要調控分子，過表達的shRNA與內源miRNA競爭相同的加工機器，必然對內源miRNA的表達和功能造成抑制作用。研究標明，目前常用的傳統shRNA對細胞內源miRNA具有較強的非特異性競爭抑制作用，在小鼠肝臟中長期高表達shRNA會造成嚴重的肝臟損傷並引發肝癌導致動物死亡。因此，如何設計一種更好的RNAi載體，在高效沉默靶基因的同時降低其毒副作用，是RNAi技術應用中亟待解決的關鍵科學問題。
吳立剛研究組博士研究生尚仁福等對具有不同莖環結構的siRNA前體的加工和功能進行了深入研究，並在此基礎上發明了一種比傳統shRNA效率更高、脫靶作用更少的新型RNAi載體。目前被廣泛使用的傳統shRNA 具有21bp或更長的雙鏈區，這種設計是基於以往的研究結果：shRNA的雙鏈區如果小於21bp就不能被細胞內的Dicer有效加工和生成siRNA。科研人員在研究中設計siRNA前體時，將雙鏈區長度小於21bp的siRNA的靶向區延伸入頂端環區域，結果雙鏈區為16-18bp的siRNA前體的加工就不再依賴於Dicer，而由RNAi的核心蛋白Ago2直接在雙鏈區3』臂（3』arm）的第10個鹼基位置進行切割，產物被細胞內的外切核酸酶進一步在3』端切短，並最終形成長度為24-27nt的單鏈siRNA。他們稱具有這種結構特徵的siRNA前體為saiRNA（single-stranded Ago2-processed interfering RNA）。saiRNA依賴於Ago2的加工途徑與細胞內一種特殊的miRNA（miR-451）的加工途徑非常類似，而介於shRNA和saiRNA兩種長度之間的siRNA前體既不能被Dicer，也不能被Ago2所加工，因此幾乎完全沒有沉默活性。進一步研究發現，saiRNA莖環結構的3』端懸垂（overhang）長度對Ago2的結合效率起決定性作用。而通常由RNA聚合酶III（polIII）轉錄生成的saiRNA末端有較長的3』端懸垂，無法直接被Ago2所高效識別和結合，影響了saiRNA的加工和沉默功能。因此，研究人員在saiRNA的3』末端融合了一種特殊的核酶（HDV ribozyme，丁型肝炎病毒核酶），利用該核酶的高效自切割活性，準確地在saiRNA的3』端產生兩個鹼基懸垂，大大提高了saiRNA前體與Ago2蛋白的結合效率，從而顯著增強saiRNA對靶基因的沉默效率。
核酶增強的saiRNA相較於傳統的shRNA具有以下優點：（1）脫靶作用（off-target）小。哺乳動物中Ago蛋白家族包含四個成員，但其中只有Ago2具有RNAi活性（切割完全互補配對RNA的核酸內切酶活性），而Ago1、3、4沒有RNAi活性卻會引起較強的脫靶作用。與傳統shRNA產生的siRNA能與所有Ago蛋白結合不同，saiRNA只有與Ago2結合後才能被加工產生成熟的siRNA，因此有效避免了由Ago1、3、4介導的脫靶作用。並且其特殊的加工方式只產生一條導向鏈（guide strand，具有基因沉默功能的siRNA鏈），不會產生passenger strand（與guide strand互補配對的沒有基因沉默功能的siRNA鏈），因此也就完全避免了由passenger strand與Ago蛋白結合後產生的脫靶作用。（2）對細胞內源miRNA的影響小。不論是化學合成的saiRNA，還是基於RNA聚合酶III的DNA表達載體在細胞內轉錄生成的saiRNA，其被加工後產生的siRNA的單位濃度分子對靶基因的抑制效率都高於傳統的shRNA。因此，在同樣的沉默效率下，saiRNA產生的成熟siRNA在細胞內的積累量要遠低於shRNA，避免了佔用大量Ago蛋白，並且其加工不需要Dicer等miRNA加工所必須的蛋白質因子，大大減少了對細胞內源miRNA加工和功能的競爭作用。
總之，saiRNA作為一種新型的RNAi載體，具有高效和低脫靶的特點，通過對saiRNA設計的繼續優化，以及動物整體的基因沉默實驗，為科學研究和基因治療應用提供更好的工具。
該研究得到了國家科技部、國家自然科學基金委以及中國科學院的經費支持。
shRNA和saiRNA加工及作用機制示意圖。shRNA轉錄後被細胞內的Dicer所識別加工後產生雙鏈siRNA，其guide strand和passenger strand都能被細胞內的Ago1-4所結合，但只有Ago2才能介導與guide strand完全互補配對的靶基因RNA的切割和沉默作用（on-target），而與guide strand結合的Ago1、3、4，以及與passenger strand結合的Ago1-4都會引起脫靶作用（off-target）。saiRNA可直接被Ago2識別並加工，其特殊的加工過程避免了產生passenger strand及其脫靶作用，而且只有與Ago2結合的saiRNA才能產生guide strand去發揮on-target的作用，從而大大減少了其它Ago蛋白引起的off-target作用。saiRNA轉錄後通常具有較長的3』端懸垂，不能被Ago2直接識別。通過在saiRNA的3』末端融合一個自切割HDV核酶，精確產生具有2個鹼基的3』端懸垂，大大促進了saiRNA與Ago2的結合效率，從而顯著提高了saiRNA的沉默效率。