2017年是CAR-T療法的元年，我們見證了兩款CAR-T療法的上市。日前，《科學》雜誌推出了新興的癌症免疫療法的特刊，回顧這些領域所取得的成就。在今天的文章中，我們一起了解風頭正盛的CAR-T細胞療法。
CAR-T細胞療法屬於過繼性T細胞轉移（adoptive T-cell transfer，ACT）的一種，這是輸血醫學的一個新領域，涉及淋巴細胞回輸以實現抗腫瘤，抗病毒或抗炎作用。該領域從臨床前研究到臨床應用一直得到快速發展，去年我們見證了兩款CAR-T細胞療法的上市，用來治療白血病和淋巴瘤。作為第一款上市的CAR-T細胞產品Kymriah的主要研發人員，賓夕法尼亞大學的Carl June教授等人在最新的《科學》綜述中，描述了目前CAR-T療法要進入主流腫瘤學領域面臨的機遇和挑戰。
▲賓夕法尼亞大學Carl H June博士（圖片來源：賓夕法尼亞大學）
1TCR-T和CAR-T
目前，ACT癌症療法主要有三種類型：腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、T細胞受體（TCR）T細胞和嵌合抗原受體（CAR）T細胞。TCR-T或CAR-T細胞是通過基因轉移技術改造外周血T淋巴細胞而生成，CAR-T已經有產品獲得FDA批准。TIL治療的原理在多個臨床試驗中得以證實，顯示出誘導轉移性黑素瘤患者的持久完全反應，其能夠靶向黑色素瘤中的新抗原。針對這些不同形式的ACT，很多製藥和生物技術公司正在進行研發和商業化。
TCR由在T細胞表面與CD3複合物非共價結合的a-和β-鏈組成。第一種進入臨床的TCR-T細胞癌症免疫療法針對的適應症是轉移性黑素瘤，使用TCR結合來自黑素細胞分化抗原的人淋巴細胞抗原A2(HLA-A2)肽。
隨後，更高親和力的TCR被開發出來，針對MART-1表位，通過降低MART-1表達來增強對癌細胞的識別。雖然這樣獲得了更高的緩解率，但會靶向表達在皮膚，眼睛和耳蝸的正常黑色素細胞。臨床中超過一半的患者出現脫靶效應（on-target/off-tumor）毒性，提示靶向共同抗原會使得有效性和毒性之間往往只是差之毫厘。另外，靶向腫瘤睪丸抗原MAGE-A3的TCRs產生致死性神經毒性和心臟毒性，也對TCR的研髮帶來新的挑戰。
然而，用表達對HLA-A2限制性肽特異性的TCR-T細胞靶向腫瘤睪丸抗原NY-ESO-1，獲得臨床有效的證據，而且沒有顯著的毒性。目前，工程化的NY-ESO-1 T細胞正在進行晚期臨床試驗 (NCT01343043)，或許針對特定腫瘤新抗原的TCR會比靶向腫瘤共有抗原更安全。這一點還需要臨床試驗進一步證實。
▲TCR-T和CAR-T細胞比較（圖片來源：《科學》）
相比之下，CAR結合了抗原結合結構域（最常見的是由抗體可變結構域衍生的單鏈可變片段（scFv）），TCRç鏈的信號結構域，以及受體（如CD28，OX40和CD137）的共刺激結構域。CAR克服了工程化TCR的某些局限性，例如需要MHC表達，MHC特性和共刺激信號。由Kuwana和Eshhar領導的小組首次表明了，這些類型的合成受體分子能夠使T細胞識別MHC非依賴性靶標。與MHC限制無關的CAR識別，使CAR-T細胞具有顯著的抗腫瘤優勢，因為腫瘤免疫逃逸的主要機制之一就是腫瘤細胞MHC相關抗原提呈的丟失。目前CAR-T細胞的一個局限性是它們需要靶向腫瘤細胞表面上的抗原。
▲TCR-T和CAR-T細胞的構成（圖片來源：《科學》）
2在B細胞血液癌症上大獲成功
事實上，使用第一代CAR-T細胞療法治療多種癌症的臨床試驗結果不盡如人意。直到2011年，靶向CD19和編碼共刺激區的第二代CAR-T細胞才成為癌症工程化T細胞治療的主要範式。CD19的幾個主要的特徵使它成為了近乎理想的治療靶點：在B細胞癌症中高表達，是人類正常B細胞發育所必需，而且不在B細胞譜系之外表達。
大多數復發性白血病患者在CD19特異性CAR-T細胞治療後獲得完全緩解。但出現了兩種形式的抗性。在急性白血病患者中，CD19抗原表位的缺失是腫瘤逃逸的主要機制。在針對青少年和小兒急性白血病患者的臨床試驗中，CD19表達陰性的患者復發率為28％。在慢性淋巴性白血病(CLL)中，尚無報導發現CD19缺失產生耐藥，CLL的耐藥性可能是由於細胞輸注後CAR-T細胞不能增殖。表2列出了CAR-T細胞療法在臨床治療中需要克服的幾個重要挑戰。
▲CAR-T細胞療法面臨的臨床挑戰和解決策略（圖片來源：《科學》）
3超越B細胞
目前，CAR-T技術已被證明除了靶向CD19之外還有更廣泛的應用，針對靶點BCMA和CD22的CAR-T細胞在治療多發性骨髓瘤和急性淋巴性白血病的早期臨床試驗中顯示出抗腫瘤療效。然而，BCMA和CD22與CD19一樣，高度局限於在B細胞系上表達，因此只對特定組織有效。靶向實體瘤相關的抗原方面仍然沒有太多進展。
ERBB2/HER2是腫瘤中過度表達的一種酪氨酸激酶受體，是許多抗體和ADC藥物的有效靶標。但是，靶向ERBB2/HER2的CAR-T細胞治療第一例患者時產生了致命的毒性。跟多研究發現毒性是由於低密度表達ERBB2的肺上皮細胞也被CAR-T細胞識別和攻擊，引發肺功能衰竭和大量細胞因子釋放。因此，研究者採用更低劑量、更低親和力的CAR- T細胞治療肉瘤患者，結果顯示是安全的，但臨床效果有限。
另外，以碳酸酐酶IX(CAIX)抗原作為靶點的一代CAR-T細胞療法在治療腎細胞癌的1期臨床試驗中也意外產生肝毒性，原因是CAIX抗原在正常膽道上皮細胞也有低密度表達，但這在臨床前研究中沒有發現。以CEACAM5作為靶點的CAR-T細胞療法在臨床試驗中，出現延遲的呼吸毒性，且與T細胞峰值擴展一致，表明癌症相關抗原潛在的on-target/off-tumor毒性。
靶向與實體瘤相關的其他共有抗原，如間皮素、癌胚抗原和GD2神經節苷脂的CAR-T療法在臨床試驗中未發現明顯的毒性；然而，這些試驗中觀察到的抗腫瘤活性也很弱。而具有增強的抗腫瘤活性的GD2特異性CAR-T細胞已經在臨床前模型中發現會誘導致命的神經毒性。
另外，腫瘤微環境是ACT療法成功應用的一大障礙，特別是在實體瘤中。包括免疫檢查點(如PD-L1表達)、腫瘤代謝環境的改變(如缺氧或吲哚胺-1-氧化酶和精氨酸酶)、調節性T細胞以及抑制性骨髓細胞。在細胞治療的過程中，這些免疫和代謝檢查點在腫瘤中的表達都會升高，表現出適應性耐藥。
目前，PD-1/PD-L1單抗與CD19 CAR-T細胞療法組合的臨床試驗正在進行中(例如NCT02926833，NCT02650999和NCT02706405)。除了與檢查點抑制劑的組合以外，研究人員還在研發阻斷這些抑制通路的替代療法，例如開關受體或基因編輯。
4CAR-T療法的毒性
接受ACT治療後，T細胞活化會產生免疫刺激和炎症反應。目前，靶向CD19、BCMA和CD22的CAR-T細胞療法都出現過嚴重的細胞因子釋放症候群(CRS)，比用TIL和TCR治療出現的流感樣症候群更加嚴重。CAR-T細胞療法帶來的CRS與腫瘤負荷相關。
此外，靶向CD19和BCMA的CAR-T細胞曾報導過意外神經系統併發症。其中CD19 CAR-T細胞療法產生的神經毒性大部分可逆，但目前還不清楚腦水腫是CRS引起的還是另外有作用機制。目前，研究人員對於T細胞免疫療法導致的CRS和腦水腫的機制仍不清楚。
▲CAR-T細胞療法的副作用：細胞因子釋放綜合症和神經毒性（圖片來源：《科學》）
5通用型CAR-T療法
儘管ACT療法屬於異基因骨髓移植，但由於MHC的原因，ACT療法目前仍集中在自體T細胞。如果可以消除MHC障礙，就能夠實現同種異體T細胞治療。與自體T細胞療法相比，通用型CAR-T細胞來源於健康供體，有可能克服許多與癌症治療相關的免疫缺陷；另外，通用型CAR-T細胞療法的製造工藝更加簡化，有望實現更快速、更便宜的「現成(off the shelf)」細胞療法產品。
最近，一項採用TALEN（轉錄激活因子效應物核酸酶）基因工程化改造的細胞在兩名患者身上進行了試驗，結果證明了現成的CD19 CAR-T細胞療法的可行性。但基因通用型CAR-T細胞的移植在兩個受試者中都受到限制，減弱了療法的有效性。重要的是，受試者1的所有MHC I等位基因發生錯配，導致了移植物抗宿主病。這意味著完全的基因編輯對於該療法的成功至關重要。另外，自然殺傷(NK)細胞對MHC I類缺陷細胞的識別也可能限制了移植。防止NK細胞溶解通用型CAR-T細胞的一種方法是插入HLA-E並刪除HLA-A，-B和-C，這樣可以阻止宿主T細胞殺死通用型CAR-T細胞。
由於該領域的快速發展，通用型CAR-T細胞可能得到廣泛應用。然而，問題是它到底能作為單藥療法還是（例如幹細胞移植或自體CAR-T細胞治療的）輔助療法。
6基因編輯和多功能CARs
有許多基因編輯工具，包括鋅指核酸酶（ZFNs），歸巢核酸內切酶（meganucleases），TALENs和CRISPR-Cas9核酸酶。這些技術已經成功應用於工程化T細胞研究。現在該領域的主要問題是源自細菌的Cas9的免疫原性是否會影響CRISPR-Cas9基因編輯的T細胞的藥物輸送。
基因組編輯有可能用來解除CTLA-4和PD-1等免疫抑制信號，增強T細胞的功能，同時避免全面阻斷免疫檢查點分子帶來的相關毒性。基因編輯也可以用於敲除T細胞表達的CAR靶點的基因，使得靶向不適用於T細胞免疫療法的抗原成為可能。最近，研究者將CAR引入TCR基因座，可以在內源性TCR啟動子的條件下控制受體表達，從而顯著增強CAR-T細胞功能。
為了減少與ACT的自身反應性免疫的潛在風險，研究人員已經開發了使基因工程T細胞誘導性死亡的合成分子系統，通常稱為「自殺開關」。最有名的方法是用促凋亡蛋白caspase-9與FKBP12（iCasp9）的結構域融合。在引入二聚體小分子例如利米德凝膠時，iCasp9的FKBP12結構域二聚化，使得T細胞經歷快速凋亡性細胞死亡。在造血幹細胞移植後的同種異體淋巴細胞輸注中評估了iCasp9方法的試驗，已經證實了強大T細胞消除能力，避免移植物抗宿主病。
7CAR-T的推廣之路
目前，全球有250多個關於CAR-T細胞的臨床試驗研究。其中，中國和美國是兩大熱門地區，歐洲、日本和南半球的臨床試驗數量要少得多。這與接受和投資新興療法的意願，衛生監管政策以及社會差異都相關。
▲CAR-T細胞療法臨床試驗的全球分布（圖片來源：《科學》）
血液癌症患者，特別是CLL和多發性骨髓瘤患者接受有效、但不能治癒的療法帶來的經濟負擔也是一大挑戰。CLL是美國最常見的白血病形式，2000年約有100,000名患者，而且目前的療法都只能改善生存狀況，並不能治癒。因此給患者帶來了巨大的經濟負擔。據估計，每名患者的終生治療費用為604,000美元，到2025年，美國的CLL的醫療費用估計超過50億美元/每年。
CAR-T細胞治療可能比現有的標準療法更具成本效益。目前高度個體化的T細胞療法的工藝需要定製，由此帶來高成本。但隨著工藝的成熟，製造成本會有所下降。
8未來機會與挑戰
治療白血病和淋巴瘤的CAR-T細胞療法的出現值得關注，有多個方面的原因。也許最重要的原因是，CAR-T是經美國FDA批准的第一種獲得推廣的基因療法。
目前，開發細胞療法的最大挑戰之一是缺乏可以評估這些複雜療法的安全性和有效性的臨床前模型，或者是對早期臨床研究中發現的安全問題的應對措施。另外，在治療實體瘤方面仍然存在許多障礙。
值得期待的是，由於工程化T細胞、基因編輯和細胞製造領域的技術進步，未來基於T細胞的療法有望擴大到其他細胞類型，如誘導多能幹細胞、造血幹細胞和NK細胞；適應症也會超越癌症，有望用於傳染性疾病、器官移植和自身免疫性疾病等各類疾病。