Cell |張鵾等揭示畸胎瘤作為多譜系人體胚胎發育模型的潛力

撰文 | 圖南

責編 | 兮

儘管發育生物學已經發展了數百年，我們對於人類早期胚胎發育的認知依舊有限。由於研究材料及科學倫理的限制，目前的發育生物學研究主要局限於各種模式動物。總體上，不同物種的發育過程具有一定的保守性，但是在某些方面也存在一些物種特異性，比如人的神經組織的發育與小鼠有很大的差別。人體多能幹細胞，包括誘導多能幹細胞的出現使得人們能夠直接在體外研究細胞的分化過程，甚至通過CRISPR技術篩選各譜系發育關鍵的調控因子。

然而，這些研究大都是在培養皿中培養細胞，即二維結構，與胚胎在體內的發育過程相去甚遠。為了克服這一障礙進而直接研究人類的早期胚胎發育，近些年研究人員利用人體多能幹細胞開發出了一系列的三維類器官模型，用以模擬不同的發育時期。但是，這些類器官模型通常局限於特定的細胞譜系。

2020年11月4日，加州大學聖地牙哥分校的Prashant Mali 教授與張鵾教授合作在Cell上發表了文章Defining the Teratoma as a Model for Multi-lineage Human Development，揭示了畸胎瘤成為多譜系人體細胞發育分化模型的潛能。

畸胎瘤是由人體多能幹細胞直接注射到免疫缺陷小鼠中直接形成的具有血管組織的複雜結構，一般能夠涵蓋胚胎的三個胚層，即內胚層、中胚層以及外胚層。能否在畸胎瘤中形成三胚層混合的結構也一度成為鑑定幹細胞多能性的黃金標準。雖然個別研究組曾經通過特定方法從畸胎瘤中分離出了少數特定的細胞譜系，但是總體而言畸胎瘤的生長具有很大的隨機性，各譜系的細胞通常混合在一起。為了克服這個問題，研究人員設想通過單細胞測序技術在單細胞水平上對畸胎瘤進行分析，並且通過CRISPR技術操縱基因表達，研究各譜系分化原理，進而優化畸胎瘤的建立過程，使其成為研究早期胚胎發育的利器。

首先，研究人員在單細胞水平上對畸胎瘤進行了完整的表徵。他們將人體胚胎幹細胞（H1）注射到Rag2和yC敲除的免疫缺陷小鼠中，大約70天後再將形成的畸胎瘤取除進行單細胞分析，得到了屬於三個胚層的合計23個細胞類型。而這些細胞類型與小鼠的早期器官形成的細胞圖譜對比分析發現，兩者具有較高的相似性，側面證明了畸胎瘤作為早期胚胎發育模型的潛能。同時也有少量的細胞類型與小鼠的細胞圖譜不盡相同。例如畸胎瘤中的造血幹細胞與小鼠的內皮細胞較為相似，提示小鼠的內皮細胞可能來源於造血幹細胞。

隨後，研究人員進一步分析了來源於不同幹細胞的畸胎瘤的異質性。除胚胎幹細胞H1外，他們將另外兩株人體胚胎幹細胞（H9/HUES62）以及人體誘導多能幹細胞PGP1 iPSC注射到小鼠體內並獲得畸胎瘤進行單細胞測序。結果表明，不同來源的畸胎瘤都包含了主要的細胞類群，但是在具體的細胞類群結構比例及畸胎瘤生長速度等方面存在一定的差異。進一步分析發現，這些畸胎瘤主要由外胚層及中胚層細胞構成，所含有的內胚層細胞較少，這與斑馬魚和小鼠的早期胚胎具有一定的相似性。

為了確定注射進小鼠體內的人體幹細胞有多少比例最後形成了畸胎瘤以及不同細胞在形成畸胎瘤的過程中是否具有譜系偏好性，研究人員利用腺病毒將一段帶有條形碼的DNA序列提前整合到幹細胞中，以便於形成畸胎瘤後從單細胞測序數據中追蹤原始細胞。他們發現大約有20%的幹細胞參與了畸胎瘤的形成過程，並且視網膜的上皮細胞具有很強的偏好性，即這些細胞在早期是由特定的一些幹細胞增殖分化而來。同時，視網膜上皮細胞的比例在不同的畸胎瘤中差異較大，說明其形成具有較高的隨機性。

鑑於畸胎瘤形成過程具有一定的隨機性，研究人員進一步表徵了其各譜系細胞所對應的胚胎發育時期。以神經細胞為例，他們單獨分析了畸胎瘤中的神經譜系相關細胞，並且進一步細化了細胞類群，鑑定出了中間神經元等新的細胞類型。通過與真實胚胎中鑑定出來的2300個相同神經譜系細胞進行對比分析，研究人員成功將畸胎瘤中的細胞投射到對應的胚胎發育時期，並且發現畸胎瘤中的神經細胞與16-17周胎兒的細胞最為接近。與此同時，結果表明畸胎瘤中的神經細胞主要是早期神經元、放射性神經膠質細胞及祖細胞，而成熟的神經元很少。最後，他們通過RNAscope的技術在畸胎瘤中確認了相關細胞譜系的存在及其空間分布。

最後，為了展現畸胎瘤作為多譜系分化模型的重要應用，研究人員選擇了與胚胎發育密切相關的24個基因進行敲除實驗。他們首先針對每個基因設計了兩條gRNAs並且驗證其敲除效率，最後選擇了16條gRNAs進行實驗。與對照組相比，特定基因敲除的誘導多能幹細胞產生的畸胎瘤在細胞的類型及比例上都出現了一定的變化。例如，已有的研究發現TWIST1基因對於中胚層細胞的分化有抑制作用，但是能促進神經上皮細胞的擴增，而由敲除TWIST1的幹細胞得到的畸胎瘤中中胚層細胞比例顯著減少，神經元和視網膜上皮細胞顯著增加。

通過TWIST1, CDX2, RUNX1, TCF4, MECP2以及L1CAM 幾個例子，研究人員充分展現了畸胎瘤用於研究一個基因在多種細胞類型完全不同功能的強大優勢。此外，研究人員還利用細胞特異性的非編碼小RNA（miRNA）對畸胎瘤做分子雕刻(molecular sculpting)的思路。簡而言之，研究人員將miRNA的結合位點放在與自殺基因（編碼具有細胞毒性的蛋白）相同的轉錄本上。在被導入細胞後，高表達對應miRNA的細胞能夠抑制自殺基因的表達而低表達或者不表達對應miRNA的細胞則會被殺死。

研究人員選取了神經細胞特異性的miRNA124作為靶標，將其導入到幹細胞中，最後發現在畸胎瘤中成功富集了神經細胞。這個基於合成生物學原理設計的自殺基因模塊具有很廣泛的通用性。簡單的把miRNA124的結合位點換成其他細胞或者組織特異表達的miRNA，畸胎瘤可以靈活塑造成不同的細胞組織結構。這將成為新一代的人體細胞組織工程以及合成生物學研究的有效利器之一。

總之，該研究通過高通量的單細胞測序對畸胎瘤進行了全方位的詳盡表徵，並且利用CRISPR技術進行基因編輯，證明了畸胎瘤作為研究早期胚胎發育模型的重要意義，最後提供了優化畸胎瘤模型，純化特定譜系的潛在方法。然而，畸胎瘤由於其本身的特性，作為發育模型的局限性依舊存在。例如，其生長過程中的隨機性導致的不同批次的畸胎瘤的異質性以及各譜系分化的不同步。為了達到足夠的可靠性，需要分析多個不同的畸胎瘤。另外單個時間點獲取的畸胎瘤還不能完全代表人體胚胎髮發育的不同階段，今後還需要對畸胎瘤演化的不同時間點做更詳細的研究。

原文連結：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.018