植物胞質分裂中成膜體的動態調控及囊泡運輸機制

摘要:在植物細胞核分裂結束後ꎬ細胞中央形成細胞板，實現2個子代細胞的細胞分離。研究植物胞質分裂過程中囊泡運輸的分子機制。對於了解植物的形態建成具有重要的意義。來源於高爾基體和反式高爾基體網絡的囊泡攜帶細胞壁物質、蛋白質和脂質運向新生細胞板位置，互相融合形成早期細胞板。隨後早期細胞板向兩端擴張並與母細胞壁融合，經過修飾後形成成熟細胞板。以微管骨架為主要成分的成膜體，作為細胞板囊泡運輸的軌道和細胞板組裝的「腳手架」參與了這一過程。本文主要綜述了植物細胞的胞質分裂過程中成膜體的形成及其動態變化過程以及細胞板囊泡拴系和融合的分子機制，同時對相關研究進行了展望。

關鍵詞：植物；胞質分裂；細胞板；成膜體；囊泡運輸

 

細胞分裂是指1個親代細胞（mothercell）分裂為2個子代細胞（daughtercell）的過程，其中包括細胞核分裂以及胞質分裂。不同生物採用不同的胞質分裂方式。在動物細胞中，隨著肌動蛋白微絲和肌球蛋白形成的收縮環（contractilering）的收緊，依次在早末期形成卵裂溝（cleavagefurrow）、晚末期形成細胞間橋（intercellularbridge），直至2個細胞相互分離。高等植物體細胞的胞質分裂則藉助成膜體（phragmoplast）和細胞板（cellplate）的協同作用來完成。成膜體作為細胞動態微管骨架網絡，以軌道和「腳手架」的形式介導了囊泡到達細胞板以及細胞板組裝的過程。隨著囊泡的不斷融合，細胞板隨之向兩端擴展，直至與母細胞壁相連，形成成熟的細胞板，至此胞質分裂結束。近年來，隨著生物化學、分子生物學和顯微成像手段的進步，植物胞質分裂中的研究取得了很大進展。本文總結了在該過程中成膜體的形成及其動態變化以及細胞板囊泡拴系、融合等分子機制，為今後的研究提供參考。

1 成膜體：細胞板囊泡運輸的軌道和細胞板組裝的「腳手架」

1.1成膜體的形成

在植物細胞周期的後期向末期轉變的過程中，有絲分裂的紡錘體細胞骨架重新組織，形成成膜體。成膜體由微管、肌動蛋白微絲以及相關的內膜組分構成，它是細胞板囊泡運輸的軌道以及細胞板組裝的「腳手架」。成膜體含有2組微管陣列，它們的正極（近端，proximal）朝向細胞分裂面，而負極（遠端，distal）朝向細胞核，形成具有雙極性的微管陣列（圖1）。這種結構是如何維持的呢？前人用「踏車模型（treadmillingmodel）」來解釋這種現象，即：微管正極朝向細胞板，不停聚合微管單體；微管負極朝向細胞核，以同樣的速度解聚，以此保持成膜體的穩定性。然而這個假說與一些試驗結果不符合。例如：1）標記微管正端的蛋白EB1可以標記整個成膜體，而不只是中間部位，還可以觀察到遠端的EB1向中間部位運動。2）按照踏車模型，應該有大量的微管蛋白單體從遠端（解聚的一端）向近端（聚合的一端）流動，但實際並沒有發現這個現象。最近，基於活細胞成像觀察以及計算機模擬，人們以動態不穩定模型（dynamicinstabilitymodel）能更好地解釋成膜體形態維持的機制。該模型認為，微管成束延伸可以在任何一個位置開始，但是近端的微管束具有更高的轉換速率，更容易聚合延伸，因此微管都是向著近端延伸。在延伸的過程中，攜帶著囊泡向細胞板運動。

大多數的微管存在於成膜體中區（midzone）的兩側，因而在螢光標記微管的圖像中，midzone顯示為一條暗線（圖1-A）。但是有一小部分的微管延伸並跨過midzone，在中間反向交錯形成重疊。此前在擬南芥中，使用電子顯微鏡和斷層攝影技術均未發現存在交錯重疊的微管，但是最近通過共聚焦顯微鏡在小立碗蘚和擬南芥成膜體中發現微管交錯的現象。在擬南芥成膜體的中部，反向微管的交聯由保守的MAP65/Asel/PRC1蛋白家族介導（表1）。原核表達的MAP65-3/PLEIAD在體外可以形成反向平行的微管陣列，如僅表達其C端的微管結合域可產生類似效果。在擬南芥根中MAP65-3定位於midzone，map65-3突變會導致主根內形成殘缺的細胞板以及多核細胞，成膜體及midzone都變得更寬。因此，MAP65-3通過在midzone結合併交聯成膜體的反向平行微管，來維持成膜體的正常形態。

1.2成膜體側向擴展

細胞板向外擴展需要成膜體做出相應的動態變化。在已形成管網狀新生細胞板結構的區域，即成膜體中央區域的微管解聚，解聚的微管蛋白單體在成膜體的前端（leadingedge）重新聚合成微管（圖1-B）。因此，一開始實心的成膜體微管陣列逐漸空心化，形成直徑不斷增大的圓環（圖1）。成膜體後端（laggingedge）微管的解聚受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯信號途徑調控[20]。MAPK級聯信號途徑的激活依賴於一個定位於細胞核以及成膜體的蛋白激酶NPK1（nucleus-andphragmoplastlocalizedproteinkinase1）與驅動蛋白NACK1（NPK1-activatingkinesin-likeprotein1）的互作。在有絲分裂前中期，依賴於周期蛋白的激酶（cyclin-dependentkinases，CDKs）對NPK1進行的磷酸化修飾抑制NPK1與NACK1的互作，從而抑制MAPK途徑。在有絲分裂的後期和末期，CDKs降解，NPK1去磷酸化後可以與NACK1進行互作，從而激活MAPK途徑，將MAP65蛋白磷酸化，使其MT-crosslinking的活性喪失，從而造成成膜體後端的微管解聚。

1.3成膜體前端的動態變化

微管蛋白成核是微管形成並延伸的前提。在植物中，微管成核作用由保守的y-微管蛋白環狀複合體（y-tubulinringcomplexes，y-TuRC）催化。在胞質分裂過程中，y-TuRC更多地存在於成膜體前端，微管從含有y-TuRC的成核位點處開始聚合，這些微管比較穩定，對戊炔草胺（propyzamide，微管解聚藥物）處理更不敏感。另外在BY-2細胞的成膜體中，前端微管被MAP65-1a優先修飾，表明MAP65-1a在成膜體前端起交聯作用，進而穩定成膜體前端（圖1-B）。

運輸囊泡一般認為是結合在驅動蛋白上沿著成膜體微管運輸到細胞板上，但目前還缺乏直接的證據。擬南芥中61個驅動蛋白中，有23個在有絲分裂過程中表達，這些驅動蛋白在維持成膜體形態上發揮重要功能（表1），但是對於它們的動力學數據以及作用機制還了解不多。

總體而言，成膜體是一個動態的、以雙極性的微管陣列為主的結構，它在引導囊泡向細胞板運輸以及細胞板的裝配過程中發揮關鍵作用。微管結合蛋白MAP65、驅動蛋白Kinesin甚至囊泡運輸相關蛋白都參與了成膜體的形成以及動態維持（表1）。

2 細胞板囊泡的來源

早期，人們普遍認為組成細胞板的囊泡來自高爾基體。這些囊泡攜帶著多糖、蛋白質和脂質等物質，從高爾基體運往反式高爾基體網絡（transGolginetwork，TGN，位於高爾基體反面但獨立於高爾基體的管網狀細胞器），再運往細胞分裂面互相融合，形成早期細胞板。因此細胞板的形成被認為是一種特殊的外泌過程。近年來，有研究發現細胞膜物質內吞後也可以運輸至細胞板。然而，特異地幹擾內質網到高爾基體的運輸或者細胞膜內吞過程，提示是外泌途徑而非內吞途徑在胞質分裂中起主要作用。在植物細胞中，外泌和內吞都可以經過TGN，因此TGN也被稱為早期內體。有些蛋白（如細胞板特有的Qa-SNARE）只在胞質分裂時期表達，合成後從高爾基體運往TGN，然後直接運往細胞板，這是一個外泌過程。有些質膜蛋白則是組成型表達，間期在質膜和TGN之間循環，不停地外泌和內吞，但在胞質分裂期間，這些內吞進來的蛋白被優先運往細胞板。

運向細胞板的囊泡是如何在TGN上形成呢？近年，人們發現ARF1的激活蛋白鳥苷酸交換因子（guaninenucleotideexchangefactor，GEF）BIG1至BIG4（BIG1-BIG4）調控TGN上細胞板囊泡的形成。外泌和內吞蛋白被運輸至TGN上後，BIG1-BIG4激活ARF1家族蛋白，激活的ARF1蛋白募集「貨物」並將其包裹到含有銜接蛋白複合體1（adaptorproteincomplex1，AP1）的網格蛋白（Clathrin）包被的囊泡中，並向細胞板運輸。另一個試驗結果表明敲除AP1複合體的μ-亞基（APlμ2）基因阻斷了外泌蛋白和內吞蛋白向細胞板轉運，導致二核細胞的形成。因此，TGN可以接受來自高爾基體的外泌囊泡和來自質膜的內吞囊泡，並在BIG1-BIG4和AP1複合體的作用下，將「貨物」包裹在Clathrin囊泡中，運向細胞板。

3 細胞板形成過程中囊泡拴系和融合

3.1 胞質分裂過程中的囊泡拴系機制

拴系是膜融合之前的囊泡相互識別過程，由拴系因子介導。目前發現有2種拴系因子複合體（TRAPPⅡ和exocyst）參與了植物胞質分裂過程（表2）。擬南芥TRAPPⅡ是由9個亞基組成的複合體，它在TRAPPI複合體（含Trs20、Trs23、Trs31、Trs33、Trs85、Bet3和Bet5亞基）的基礎上，增加了2個特有的亞基（Trs120和Trs130）。這2個亞基定位在TGN和細胞板上，它們的基因突變導致胞質分裂的缺陷（表2）。exocyst複合體由8個亞基（SEC3、SEC5、SEC6、SEC8、SEC10、SEC15、EX084和EX070）構成，其中5個亞基已被發現定位在細胞板上（表2）。EXO70A1基因突變影響了細胞板的裝配過程；SEC6可以和SEC1/Munc18蛋白KEULE直接互作，意味著細胞板囊泡拴系過程與融合過程存在直接的關聯。TRAPPIⅡ和exocyst可以相互作用，並且Trs120和7Trsl30基因突變導致exocyst複合體錯誤定位，意味著TRAPPIⅡ複合物作用於exocyst的上遊（圖2）。

Rab家族小G蛋白往往參與調控多個囊泡運輸過程，其中RabA1-RabA3亞家族被證實與胞質分裂相關。RabA2a和RabA2d定位在細胞板的邊緣和TGN上，誘導表達顯性失活態的RabA2a導致胞質分裂缺陷（表2）。RabA1c和TRAPPIⅡ複合體亞基Trsl30共定位在細胞板和TGN上。在trsl30突變體中，RabA1c定位在細胞質中，而且GTP結合態的RabA1c（Q72L）能夠部分回補trs130的表型，因此TRAPPⅡ可能是RabA1c的GEF。另外一個可能參與胞質分裂的是RabE亞家族蛋白，RabE1d定位在細胞板上。SCD1和SCD2作為RabE可能的GEF，其缺失導致胞質分裂的缺陷（表2），RabE的下遊可能是exocyst複合體。

3.2 胞質分裂過程中的囊泡融合機制

囊泡運輸至細胞分裂面之後，將互相融合形成細胞板。膜融合過程主要由SNARE蛋白複合體介導。SNARE複合體一般由4個α-螺旋組成，這4個α-螺旋可能來自3~4個SNARE亞基。SNARE亞基依據它們在SNARE基序上的核心胺基酸進行分類，包括：Qa-SNARE、Qb-SNARE、Qc-SNARE和R-SNARE，在某些情況下Qb-SNARE和Qc-SNARE可以被同時具有Qb-和Qc-SNARE基序的Qbe-SNARE取代（表2）。

在植物胞質分裂過程中，有一個被稱為KNOLLE的Qa-SNARE發揮了關鍵作用（表2）。它在細胞分裂中期特異表達，在胞質分裂結束後被降解。KNOLLE參與形成2種SNARE複合體。一種是由它和Qbc-SNARESNAP33以及R-SNAREVAMP721/722組成；另一種是由它和Qb-SNARENPSN11、QC-SNARESYP71以及R-SNAREVAMP721/722組成。2種SNARE複合體對胞質分裂都有貢獻（圖2）。

SM（SEC1/Munc18）蛋白是膜融合的主要調控蛋白之一，它可以與Qa-SNARE互作並且促使SNARE複合體的形成。儘管SM-SNARE互作模式可能具有多種，一般來講，SM蛋白是和Qa-SNARE的N端互作，並且進一步與形成的SNARE複合體互作。在植物胞質分裂的過程中，SM蛋白KEULE可以和KNOLLE蛋白N端與SNARE基序之間的「鉸鏈」區域互作，並且KEULE能夠更好地與處於開放構象的KNOLLE單體互作，而不是與SNARE複合體互作。這種互作能夠促使KNOLLE蛋白處於穩定的開放構象，有利於SNARE複合體的形成和細胞板囊泡融合的過程。除了與KNOLLE蛋白互作之外，KEULE還與成膜體形態的轉換相關。有研究表明，在heule突變體中，很多處於分裂期的細胞成膜體不能從實體向空心的環狀進行轉換，但其中的分子機制還有待進一步研究。

在酵母和果蠅中有一類叫做Tomosyn的蛋白在膜融合過程中起負調控作用，擬南芥Tomosyn蛋白（AtTMS）可以和KNOLLE互作，這種互作導致KNOLLE不能和其他的SNARE亞基互作，進而抑制細胞板的囊泡膜融合過程，導致主根中細胞板形態缺陷。

4 細胞板邊緣與母細胞質膜的融合過程

不斷伸展的細胞板最終會接觸到母細胞的質膜。此時囊泡是僅與細胞板邊緣融合還是同時和質膜融合，目前還不清楚。一般而言，介導細胞板膜融合的SNARE複合體中的Qa-SNARE是KNOLLE和SYP132，而介導囊泡與質膜融合的SNARE複合體中的Qa-SNARE是PEN1（SYP121）、SYP132等。在heule和knolle突變體中，細胞分裂區積累了大量的囊泡，意味著這些囊泡不能通過其他的SNARE複合體來與質膜融合。細胞板與質膜的融合是哪些SNARE複合體在發揮作用？目前還不清楚。

TPLATE基因突變導致細胞板不能與母細胞膜融合。TPLATE是一類銜接蛋白，它定位在細胞板以及皮質分裂區（corticaldivisionzone，CDZ）。咖啡因處理會擾亂TPLATE定位到細胞板而非CDZ，而wortmannin（內吞抑制劑）處理會擾亂TPLATE定位到CDZ而非細胞板的過程，因此TPLATE定位至2個部位的機制不一樣。進一步研究表明TPLATE蛋白是內吞銜接蛋白複合體（TPLATEcomplex）的一個亞基，它參與了植物細胞網格蛋白（Clathrin）包被囊泡的形成。網格蛋白包被囊泡的銜接蛋白除TPLATE之外還有AP2，植物細胞內吞主要依賴前者，而非植物細胞內吞主要依賴於後者。因此，植物AP2亞基的基因突變體並沒有出現嚴重的表型。目前，TPLATE通過內吞作用介導細胞板與母細胞膜融合的機制還不清楚。

5 細胞板的成熟

細胞板在形成過程中會經歷一系列形態變化，最終形成一個扁平的成熟細胞板。這一系列變化過程主要包括囊泡管網化，通過內吞除去細胞板多餘的膜組分，以及置換其中的多糖成分。

在細胞板成熟過程中，網格蛋白包被的囊泡以及發動蛋白相關蛋白（dynamin-relatedproteins，DRP）發揮重要作用。DRP是一類大分子的GTPase，擬南芥DRP1家族有5個成員（DRP1a-DRP1e）。DRPla和DRP1e定位在細胞板上，drpla與drple雙突變導致胚胎致死，突變體胚胎出現多核細胞以及腫脹、不規則的細胞板殘端[6]。DRP2家族含有2個成員（DRP2a和DRP2b），drp2a與drp2b雙突變導致擬南芥配子體致死，其中雄配子體發育在第1次有絲分裂時期受阻，細胞板呈現分支、捲曲的形態[68]。研究表明在細胞板的前端，DRP能將囊泡束緊，變成管狀結構，有利於二維格柵（lattice）的形成。而在細胞板的中間，DRP能通過水解GTP，益裂網格蛋白包被囊泡，使之脫離細胞板。因此，DRP1和DRP2家族成員在細胞板成熟過程中均發揮功能，但其功能是不冗餘的。

除了細胞板膜組分的內吞，細胞板囊腔中的多糖組分在後期也會發生改變。在細胞板形成的早中期，其中的多糖主要是胼抵質，它由被遞送至細胞板的胼脹質合酶合成。胼胝質能提供一定的機械強度，穩定細胞板管網結構，並在細胞板插入到母細胞膜的過程發揮功能。在細胞板成熟期間，胼抵質水解後被纖維素取代，這使得成熟細胞板更加牢固。

6 總結和展望

基於正向和反向遺傳學的研究策略，以及採用遺傳學、生物化學、電子顯微鏡、雷射共聚焦顯微鏡等研究技術，前人在植物特別是擬南芥中分離了許多與成膜體的形態建成以及維持、細胞板囊泡拴系/融合的相關基因，並對其作用機制進行了解析。但是，植物胞質分裂過程的分子機制中還有很多關鍵問題有待回答。這些問題包括：1）囊泡如何沿著成膜體運往細胞分裂面？儘管目前發現很多驅動蛋白突變體確實有胞質分裂缺陷，但是它們往往是影響了成膜體形態，未造成囊泡堆積，到底是哪一類驅動蛋白和囊泡結合併運輸囊泡，目前還不清楚。2）細胞板上囊泡的拴系和融合如何協調？目前儘管發現KEULE既可與拴系因子exocyst複合體互作，也可與融合蛋白KNOLLE互作，拴系因子TRAPPⅡ可以與exocyst互作，但四者如何協調還很不清楚。3）細胞板如何與母細胞膜進行融合？4）細胞板囊泡融合與成膜體動態變化如何協調？其中的具體分子機制是什麼？隨著超高解析度螢光顯微鏡技術、三維電子顯微鏡技術和蛋白質互作研究等的應用，人們對於植物胞質分裂中的囊泡運輸機制了解將會越來越清晰。例如，通過超高解析度螢光顯微鏡可能直接觀察囊泡在成膜體微管上的運輸；通過免疫共沉澱結合質譜（IP-MS）技術可以大量鑑定細胞板運輸相關蛋白的互作蛋白；利用酵母三雜交技術可以觀察多對蛋白的互作關係。通過上述技術，人們有望在不遠的將來更加清晰地解析植物胞質分裂過程中的分子調控機制。

作者及單位：

譚小雲、賈辛怡、鮑依群

南京農業大學生命科學學院