UPLC特徵圖譜為鑑別重樓真偽提供新選擇

2020-11-23 人民網陝西站

原標題：UPLC特徵圖譜為鑑別重樓真偽提供新選擇

　　重樓藥材及飲片為《中國藥典》2015年版一部收載品種，為百合科植物雲南重樓或七葉一枝花的乾燥根莖，具有悠久的藥用歷史。

　　近年來，我國重樓的生長環境遭到破壞，植物繁殖率低，資源再生較慢，各產區藥材蘊藏量普遍下降，且市場上的雲南重樓飲片存在混偽品。因此，需要建立一種可以有效鑑別雲南重樓的分析方法，以控制重樓藥材及飲片的質量。

　　創新實驗設計方案

　　儀器

　　Wat er s ACQUITY UPLC型高效液相色譜儀；ELMA P120H型超聲波清洗器；默克Mil l i-Q純水系統；Mett l er XS 105 Du十萬分之一天平；Met tl er AE240萬分之一天平。

　　材料

　　藥材：雲南重樓（編號為1~10）、華重樓（編號為11~13）、偽品（編號為14~20），樣品經中國食品藥品檢定研究院鑑定。

　　試藥：偽原纖細薯蕷皂苷（批號：Y19F7H9835，純度98%）、重樓皂苷H（批號：Y21A9H68360，純度98%）、纖細薯蕷皂苷（批號：CF0227QC14，純度98%）、重樓皂苷Ⅴ（批號：Y19F7H9835，純度98%）、重樓皂苷Ⅶ（批號：111593-201604，純度94%）、重樓皂苷Ⅵ（批號：111592-201604，純度98%）、重樓皂苷Ⅱ（批號：111591-201604，純度96.1%）、薯蕷皂苷（批號：111707-201703，純度91.4%）和重樓皂苷Ⅰ（批號：111590-201604，純度93.6%）。

　　試劑：甲醇（色譜純，Lot.152023，Fisher公司）和乙腈（色譜純，Lot.150942，Fisher公司），水為默克Mil l i-Q制超純水。

　　溶液的製備

　　對照品溶液：分別精密稱取偽原纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ對照品適量於1ml量瓶中，以甲醇定容至刻度，即得各對照品儲備液。分別取各對照品儲備液適量於量瓶中，甲醇定容至刻度，即得對照品單標溶液。

　　供試品溶液：本品粉末（過三號篩）約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，稱定重量，加熱回流30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

　　色譜條件與系統適應性試驗

　　色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱（2.1mm×100mm，1.8μm）；以乙腈為流動相A、水溶液為流動相B進行梯度洗脫（表）；流速0.3ml/min，進樣量10μl，柱溫40℃，檢測波長203nm，記錄35分鐘的色譜圖。

　　方法學考察

　　精密度試驗：按照色譜條件與系統適應性試驗的色譜條件，精密吸取同一供試品溶液，連續進樣6次，每次10μl，所得特徵峰的相對保留時間的RSD（相對標準偏差）均＜0.78%，特徵峰的相對峰面積RSD均＜2.28%（n=6），表明儀器精密度良好。

　　穩定性試驗：精密吸取同一供試品溶液，於配製後的0、4、8、12、16、24小時進樣，所有特徵峰的相對保留時間的RSD均＜1.13%、相對峰面積的RSD均＜2.56%（n=6），表明供試品溶液在配製後24小時內穩定。

　　重複性試驗：取同一批號樣品，按供試品溶液製備方法平行製備6份供試品溶液，依法測定，所得特徵峰的相對保留時間的RSD均＜0.96%，特徵峰的相對峰面積的RSD均＜2.87%（n=6），結果表明本方法重複性較好。

　　特徵圖譜比較研究

　　雲南重樓特徵圖譜的建立

　　取10批雲南重樓樣品粉末，精密稱定，製備供試品溶液，精密吸取10μl，分別進樣測定，記錄35分鐘的UPLC（超高效液相色譜）色譜圖。採用ChemPattern化學計量學軟體對實驗室數據進行分析處理，設定樣品1、3、7、10為代表性圖譜生成共有模式圖，將其他樣品的色譜峰與共有模式圖進行自動匹配，生成雲南重樓的特徵圖譜，計算樣品1～10與特徵圖譜的相似度，結果表明，各批雲南重樓正品之間的相似度均大於0.70，說明相似度良好。

　　特徵峰的標定

　　根據10批雲南重樓的特徵圖譜檢測結果，共標定8個特徵峰。經過與對照品比對，並結合DAD光譜，可知1號峰為偽原纖細薯蕷皂苷、2號峰為重樓皂苷Ⅶ、3號峰為重樓皂苷H、4號峰為重樓皂苷Ⅱ、5號峰為薯蕷皂苷、6號峰為纖細薯蕷皂苷、7號峰為重樓皂苷Ⅰ、8號峰為重樓皂苷Ⅴ。

　　華重樓與雲南重樓特徵圖譜比較

　　取不同批次的華重樓（樣品11~13）粉末，精密稱定，製備供試品溶液，分別進樣測定，記錄35分鐘的UPLC色譜圖，圖中主要包含3個峰，其中1號峰為重樓皂苷Ⅶ。華重樓與雲南重樓特徵圖譜的主要區別為：雲南重樓中具有較高含量的薯蕷皂苷類成分，如重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷等，而華重樓幾乎不含上述成分。採用ChemPat tern化學計量學軟體對實驗數據進行分析處理，計算樣品11~13華重樓與特徵圖譜的相似度，發現華重樓和雲南重樓特徵圖譜差異大，存在顯著不同。

　　偽品與雲南重樓特徵圖譜比較

　　取不同批次的偽品（樣品14~20）粉末，精密稱定，製備供試品溶液，分別進樣測定，記錄35分鐘的UPLC色譜圖，圖中主要包含3個峰，其中1號峰為重樓皂苷Ⅶ，3號峰為重樓皂苷Ⅵ。本實驗中收集到的偽品與雲南重樓特徵圖譜的主要區別為：雲南重樓同時含有重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷和重樓皂苷Ⅰ，而偽品幾乎不含上述成分。同時，重樓皂苷Ⅵ為偽品的主要成分，雲南重樓和華重樓中幾乎不含該成分。採用ChemPat ter n化學計量學軟體對實驗數據進行分析處理，計算樣品14~20偽品與特徵圖譜的相似度，發現偽品和正品特徵圖譜差異大，存在顯著不同，可用於重樓的鑑別和質量控制。

　　化學計量學分析

　　將色譜儀採集的數據以*.cdf格式導出，再導入ChemPat t er n化學計量學軟體，對相應的色譜峰進行積分，按樣品對峰面積進行標準化處理，再進行聚類分析和主成分分析。分析數據顯示，建立的特徵圖譜方法採用聚類分析和主成分分析均能夠將雲南重樓和其他樣品（華重樓、偽品）分成2組，進一步再將華重樓與偽品分為2組，從而達到鑑別的目的。

　　科學有效辨別偽劣

　　檢驗人員通過UPLC梯度洗脫法建立了雲南重樓的特徵圖譜，獲得了雲南重樓化學成分的整體情況，且35分鐘內完成分離。其主要成分偽原纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷H、重樓皂苷Ⅱ、薯蕷皂苷、纖細薯蕷皂苷、重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅴ的分離效果良好。此外，在通過二極體陣列檢測器考察最適紫外吸收波長時，綜合考慮8個主要成分的最大吸收，最終選擇203nm為檢測波長。

　　經檢驗，10批雲南重樓UPLC圖譜與特徵圖譜之間的相似度均大於0.70，相似度良好，表明各批次雲南重樓的化學成分種類、比例相似，而3批華重樓與特徵圖譜之間相似度為0.26~0.37，說明《中國藥典》規定的重樓兩個正品品種雲南重樓和華重樓化學成分存在差異；7批偽品UPLC圖譜與特徵圖譜之間相似度均小於0.22，相似度較低，與正品化學成分差異較大。由聚類分析和主成分分析結果可知，兩種分析方式均能夠將雲南重樓、華重樓和偽品區分開來。

　　由此可見，本實驗建立的雲南重樓特徵圖譜可以有效區分雲南重樓、華重樓和偽品，為有效控制重樓質量提供了科學依據。【本文摘編自高妍 李德旺 過立農 馬雙成劉傑 鄭健 昝珂.雲南重樓UPLC特徵圖譜研究[J].中國食品藥品監管.2019.9(188)：38-44】

(責編：左瑞、鄧楠)

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