免疫沉澱如何規避輕重鏈幹擾?

2020-12-04 每日生物評論

免疫沉澱 (Immunoprecipitation，IP) 是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。抗體與細胞裂解液或表達上清中相應的蛋白結合後，再與ProteinA/G偶聯的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G-抗體-目的蛋白複合物，沉澱經過洗滌後，重懸於電泳上樣緩衝液，煮沸5-10min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。

在免疫沉澱實驗後的WB驗證環節中，當使用常規的 Anti-IgG (H+L) 酶標二抗時，通常會出現對應免疫沉澱一抗變性後產生的重鏈（50kDa）和輕鏈（25kDa）兩條帶。如果檢測的目的蛋白分子量在此附近時，就會受到這兩條帶的幹擾。

如何避免IP檢測過程中的重、輕鏈幹擾？

一般解決辦法：選擇不同種屬來源的一抗分別進行IP和WB實驗，然後再選擇無種屬交叉反應的二抗進行WB實驗；這種方案相對來說比較昂貴，需要買兩個一抗和兩個對應的二抗。

Abbkine解決方案：產生此問題的重點在於實驗中目的蛋白的信號模糊，無法進行判斷，那就需要在根本上將幹擾的信號降到最低，而IPKine系列二抗經過特別設計和優化，可以和重/輕鏈特異性結合從而明顯看到目的蛋白信號。如果目的條帶在55kDa左右，可以通過選擇與輕鏈特異性結合的二抗，來消除重鏈條帶對目的蛋白檢測的幹擾。如下圖：

IPKine是一系列新型的二抗產品，能有效解決IP-WB後的輕/重鏈幹擾問題。IPKine系列二抗經過特別優化，不會與IgG的輕/重鏈分子結合，只識別IgG分子的重/輕鏈部分，從而能有效解決IP實驗後的WB檢測中面臨的輕/重鏈幹擾信號降到最低。

另外，IPKine系列二抗經過特別優化，其針對目的種屬的特異性非常高，同時針對其他非目的種屬的抗體分子的非特異性結合降到最低，從而有效避免了二抗與樣本內免疫球蛋白分子的非特異性雜交，提高實驗的特異性和信噪比。

IP實驗常見問題匯總：

文章來源：每日生物評論

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