這是一個抗體與蛋白的故事......
男主：IP捕獲抗體
女主：IP目的蛋白
情節：請自行腦補
精髓：容我為您娓娓道來......
免疫沉澱（Immunoprecipitation, IP）是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法。作為一種用來研究天然狀態下蛋白質作用的技術，IP在科研上應用廣泛。它可以用來富集或者分離天然狀態的蛋白或者相互作用的蛋白複合物（比如免疫共沉澱Co-IP），還可以研究蛋白質與染色質DNA間的相互作用（ChIP）等等。
【原理篇】
抗體與細胞裂解液或蛋白表達上清中相應的蛋白結合後，再與蛋白A/G（ProteinA/G）（或二抗）偶聯的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子-蛋白A/G（或二抗）-抗體-目的蛋白複合物。複合物沉澱經離心洗滌後，重懸於電泳上樣緩衝液，沸水浴5-10 min，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體（輕鏈和重鏈已斷開）和靶標蛋白。該上清混合物經SDS-PAGE電泳分離和Western blotting顯影，最終依據顯影后的膠片上是否有目的蛋白條帶，來判斷免疫沉澱實驗是否成功。
【流程篇】
1、Lysate的製備
這一步實驗操作So easy，相信大家看圖就能懂。
2、免疫沉澱（捕獲目的蛋白）
1）1-3 mg lysate中加入3-5 ug 一抗，4℃旋轉過夜，形成「目的蛋白 & 抗體」的二聚體；
2）加入50 ul 經PBS或孵育液處理過的proteinA/G beads，4℃旋轉1-4 h，形成「目的蛋白-抗體-proteinA/G」的三聚體；
3）洗滌液洗滌5次，去除雜蛋白；
4）pH2.0酸洗脫，充分洗脫下抗體和目標蛋白。
PS 第4步也可以採用煮沸法，即：添加sample loading buffer（終濃度1 X）煮沸5~10 min，12000 rpm 離心3 min，取上清備用。
3、WB檢測
常規Western Blot操作，此處省略幾萬字......
↑↑↑以上內容是科普環節↑↑↑
也許您會覺得很low？
很沒勁？
OK，憋著急！
我發si：前方絕對高能！
☆ lysate製備
全程注意低溫操作：細胞收集用的PBS要冰上預冷，組織勻漿冰上操作。
液氮研磨VS玻璃勻漿：組織多優先使用液氮研磨；組織少的使用冰浴玻璃勻漿器。
裂解液常用RIPA：裂解液中需添加一定量的蛋白酶抑制劑，如苯甲基磺醯氟(PMSF)、釩酸鈉(Na3VO4)等。
注意超聲：細胞一般180 W超聲1~2 min（超2 s停2 s）；組織可180 W超聲2~5 min（超2 s停2 s）。（不要問小編為什麼要超聲步驟，小編回答是6個字：為了實驗成功）
☆ 目的蛋白富集
關於酸性洗脫和煮沸法選擇：酸性洗脫適合於所有大小蛋白的洗脫，且背景更乾淨；煮沸法因可能會將Beads上少量protein A/G煮脫下來，一般不建議用於＜50 kDa 的目的蛋白。
Beads-Protein A & Beads-Protein G選擇依據：先看表，咱們再解釋！！！
從上表可見，如果用兔抗體(或小鼠IgG2a/2b/3)捕獲，那麼應採用Beads-Protein A；
如果用小鼠IgG1抗體捕獲，那麼應採用Beads-Protein G
IgM和IgA類的單抗不適合做IP，一方面因為這兩類抗體分子結構柔韌性較差，在裂解液中容易失活而失去捕獲抗原的能力；另一方面因為普通的填料在裂解液中都無法有效捕獲這兩類抗體，從而也容易出現陰性結果。
☆ WB檢測
二抗的選用技巧（本篇重點內容！）
如果你覺得IP中WB跟普通WB一樣去選二抗，
那小編只能說你：
Too Young Too Simple！
因為通過免疫沉澱富集的產物中除了目的蛋白，還有抗體重鏈和輕鏈。當目的蛋白大小接近抗體重鏈或輕鏈時，如何避免抗體重/輕鏈的幹擾？容小編教你兩招：
第一招
巧用HRP-protein A二抗類似物或Mouse anti-Rabbit Light chain antibody
相比常規的羊抗兔或羊抗鼠二抗，使用HRP-protein A二抗類似物能有效降低對抗體重鏈的結合、基本消除對抗體輕鏈的結合；而Mouse anti-Rabbit light chain antibody則能有效消除對兔抗重鏈的結合，這樣，可組合選用二者作為WB二抗。
在目的蛋白大小在45~55 kDa時，選用Mouse anti-Rabbit light chain antibody作為WB二抗，其餘大小範圍可選用HRP-protein A二抗類似物。
有圖有真相
小編Show 兩張圖讓你感受一下：
第二招
捕獲抗體和WB檢測一抗選用不同種屬來源抗體
捕獲抗體和WB檢測一抗選用不同種屬來源抗體，配合種屬特異性二抗，屏蔽IP洗脫時的抗體重輕鏈幹擾。
不多說，直接上圖：
左例圖中IP捕獲蛋白用鼠單抗ATP5A1（CatNo.66037-1-Ig），WB檢測用兔多抗，
Control IgG：Normal Mouse IgG，二抗為HRP-Goat anti-Rabbit IgG；
右例圖IP捕獲蛋白用兔多抗CD274（CatNo.17952-1-AP），WB檢測用鼠單抗，
Control IgG：Normal rabbbit IgG，二抗為HRP-Goat anti-Mouse IgG）。
如果你有輕微圖片恐懼症：圖多、眼花
莫慌！
我們已經為你準備好了：
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細節決定成敗
來源：ProteintechGroup
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