項目文章PC：水稻 RDR6 在減數分裂DNA雙鏈斷裂形成中的作用機制

前言

2020年10月，中國科學院遺傳與發育生物學研究所程祝寬研究員、南京農業大學吳玉峰教授為共同通訊作者，在Plant Cell雜誌（IF=9.618）發表題為「Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6 Contributes to Double-Strand Break Formation in Meiosis」的研究論文，該研究對OsRDR6（Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6）參與水稻減數分裂DSB（雙鏈斷裂，Double-strand Break）形成的分子機製做了深入探索。博士研究生劉長振、助理研究員沈懿、以及已畢業的覃寶祥博士為論文的共同第一作者。文章中 RNA-seq、small RNA 測序、WGBS 由歐易生物提供服務。

據悉，程祝寬研究員長期從事水稻減數分裂方面的研究，在該領域取得一系列原創性科研成果，國際上享有盛名；而作為青年一代的吳玉峰教授，回國以後在計算生物學領域已發表多篇具有影響力的科研論文。

研究背景

由於在抗病毒防禦中的作用，植物RNA依賴性的RNA聚合酶（RDR）被廣泛研究，RDRs的作用與相關的DICER類蛋白和AGO（Argonaute）蛋白功能密切相關。RDR6是RDR家族中的一個重要成員，其在small RNA介導的基因沉默過程中發揮著極其重要的功能。已有的研究表明RDR6在PhasiRNA (Phased small interfering RNA) 以及TasiRNA (Trans-acting small interfering RNA)的合成過程中發揮作用，並因此參與到抗病以及器官發育等多個過程。然而，目前對OsRDR6在減數分裂中的作用機制仍不清楚。

研究內容

本文基於一個可引起減數分裂特異表型的 OsRDR6 新等位突變體Osrdr6-meiosis (Osrdr6-mei ) 展開一系列研究，解釋了RDR6參與減數分裂過程中DSB形成的基本機制。作者首先將 OsRDR6 的野生型基因組序列導入純合Osrdr6-mei 突變體中，在遺傳上證實突變體的不育是由 OsRDR6 基因突變所引起。進而通過基因敲除（CRISPR-CAS9）以及等位雜交實驗構建了雙等位突變體Osrdr6-bi，發現OsRDR6對於減數分裂DSB形成是必不可少的。Osrdr6-mei 中small RNA的表達變化表明，水稻減數分裂過程中small RNA的合成調控依賴於RDR6。此外，WGBS分析還發現OsRDR6對small RNA的調節作用顯著影響全基因組DNA甲基化水平。在 Osrdr6-mei 中，small RNA表達差異導致與DSB形成相關的三個基因下調，這可能就是突變體中減數分裂DSB形成異常的原因。

研究路線

研究結果

1. 水稻不育突變系特性研究

首先，採用秈稻品種中秈3037獲得不育突變株，其表現出正常的營養生長，卻完全不育。自交雜合植株後代中可育株與不育株的分離比例為3：1，表明不育表型受1對隱性核基因控制。進一步將目的基因定位在1號染色體的長臂上，發現1個候選基因編碼水稻中的RDR6蛋白，故將該突變體命名為 Osrdr6-mei。

圖1 Osrdr6-mei 表型分析

2. 水稻DSB形成需要OsRDR6

通過染色體行為分析和螢光原位雜交(FISH)實驗確認Osrdr6-mei 花粉母細胞中的部分同源染色體在粗線期不能配對，在終變期可明顯檢測到單價體（不能配對的同源染色體）。進一步通過對花葯進行半薄切片實驗發現Osrdr6-mei 的花粉母細胞在減數分裂後期逐漸開始解體，表明減數分裂細胞可能已經凋亡。採用特異性識別磷酸化形式的水稻組蛋白γH2AX抗體進行免疫螢光染色來監測DSB形成，結果表明突變體中DSB的數目顯著減少。

圖2 Osrdr6-mei的細胞學分析

為進一步證實OsRDR6在減數分裂DSB形成中的作用，作者進一步構建了Oscom1 Osrdr6-mei 雙突變體。當 OsCOM1 功能喪失會導致非同源染色體粘連（這類非同源染色體的粘連是由於DSB修復異常所致，故粘連的發生依賴於DSB的形成），而在雙突變體中，異常染色體粘連的現象受到部分抑制。該結果在遺傳上證實 Osrdr6-mei 中形成的DSB較少。

3. 雙等位突變體Osrdr6-bi分析證實OsRDR6是DSB形成所必需

利用CRISPR-CAS9系統及等位雜交技術創建的雙等位突變體Osrdr6-bi，其不育表型與生長狀態同 Osrdr6-mei 類似。Osrdr6-bi 中，在減數分裂粗線期沒有觀察到同源染色體配對，且超過90%的減數分裂過程均受阻。

圖3 Osrdr6-bi 的遺傳構建和細胞學分析

由於ZEP1是水稻聯會複合體（Synaptonemal Complex, SC）的重要成分，對其進行免疫螢光染色發現：在 Osrdr6-bi 中ZEP1信號呈點狀分布，表明 Osrdr6-bi 中SC的形成不正常。且在 Osrdr6-bi 中沒有觀察到明顯的γH2AX信號，表明DSB的形成被完全阻斷。11號染色體全長FISH以及DSB修復相關的其它蛋白免疫螢光染色實驗也證實OsRDR6對於減數分裂DSB的形成是必需的。

圖4 野生型和 Osrdr6-bi 減數分裂細胞的FISH和免疫螢光染色分析

4. Osrdr6-mei 突變體對small RNA生物合成的影響

細線期花葯small RNA測序結果顯示，small RNA的長度在21-nt有一個主峰，在24-nt處有一個較小的峰。在 Osrdr6-mei 中，21-nt small RNA數量顯著低於野生型，而24-nt small RNA數量顯著高於野生型。進一步的分析表明，在 Osrdr6-mei 中表現出最顯著豐度降低的21-nt small RNA主要來自於基因組中的 phased 位點和未注釋區域，而在 Osrdr6-mei 中豐度顯著上調的24-nt small RNA來自基因座、重複相關區域和未注釋區域。

圖5 來自small RNA測序的大小分布、注釋和空間分布

通過分析位於基因和轉座元件(TE)位點附近的small RNA發現，與野生型相比， Osrdr6-mei 有更少的21-nt small RNA，卻有更多的24-nt small RNA，推測OsRDR6調控減數分裂花葯中的small RNA表達。

5. Osrdr6-mei 的DNA甲基化提升

對野生型和 Osrdr6-mei 花葯進行WGBS，結果顯示，在 Osrdr6-mei 中的非TE基因上下遊1kb和TE附近區域CHH甲基化水平要高得多，而且在 Osrdr6-mei 中發現了更多的CHH高DMR，揭示OsRDR6可能在DNA甲基化中起負作用。

圖6 DNA甲基化與small RNA之間的關係

在 Osrdr6-mei 中，CHH 高DMR對應的24-nt small RNA和21-nt small RNA的豐度明顯更高；在CHH低DMR對應的24-nt small RNA的豐度同樣更高，這意味著24-nt small RNA與DNA甲基化之間存在較為複雜的關係。

6. Osrdr6 突變體中 CRC1、P31comet 和 OsSDS 的表達水平降低

轉錄組測序共鑑定出778個差異表達基因，其中321個基因上調，457個基因下調。有422個(54%)與差異表達的24-nt small RNA有關。這些結果提示與 OsRDR6 相關的small RNA可能對基因表達有普遍性地影響。

圖7 在 Osrdr6 突變體中，CRC1、P31comet 和 OsSDS 下調表達

重點基因 CRC1、P31comet 和 OsSDS 是水稻減數分裂DSB形成所必需的，這些基因都是顯著下調的，螢光定量PCR結果也證實相同的變化趨勢。通過免疫螢光染色實驗發現，CRC1 和 P31comet 蛋白在 Osrdr6-bi 的花粉母細胞染色體中未檢測到信號，推測 OsRDR6 可能通過調節水稻中 CRC1、P31comet 和 OsSDS 的表達水平來調控減數分裂DSB的形成。

7. Osrdr6-mei 上下調基因受不同途徑調控

通過聯合分析觀察DEG周圍small RNA豐度變化，推測在 Osrdr6-mei 中，啟動子和3』調控區24-nt small RNA表達的增加可能與基因沉默(下調)有關，而相關基因的上調可能是21-nt和24-nt small RNA表達差異的綜合結果。

圖8 small RNA和基因表達之間的關係

由於植物中small RNA結合到AGO蛋白是由其5』末端核苷酸類別所介導，而映射到相關基因啟動子和3』調控區上的24-nt small RNA的5』末端核苷酸都偏向腺嘌呤，表明這些small RNA中的大多數可結合到AGO2或AGO4蛋白上。

從small RNA在上調基因周圍區域的分布來看，其調控機制比下調基因更為複雜。DMRs結果中相關的差異基因不包括CRC1、P31comet 和 OsSDS，這表明這些與減數分裂相關的基因表達水平改變，不是直接由small RNA介導的DNA甲基化水平改變所致，這其中的具體作用機制還有待繼續深入研究。

研究結論

本文為OsRDR6在調節減數分裂DSB形成提出了一個潛在模型。在野生型中，OsRDR6與其他small RNA合成蛋白共同合作，以維持絨氈層細胞和減數分裂細胞中small RNA表達的平衡。在 Osrdr6-mei 中，OsRDR6功能異常導致24-nt small RNA表達升高，特別是在下調基因的啟動子和3』調控區，並因此導致這些基因的表達水平降低。此外，這些24-nt small RNA更有可能與AGO2/4蛋白相結合併組裝成small RNA介導的沉默複合體來抑制這些基因的表達。

編者按

本文克隆了一個新的水稻 RDR6 突變體，Osrdr6-mei ；並解析了其在減數分裂過程中特異產生表型的分子機制。文中，作者首先確認不育性狀是由OsRDR6突變引起，其次利用small RNA測序、WGBS和RNA-seq技術，揭示了OsRDR6對於調節減數分裂時期花葯中small RNA平衡是重要的。在突變體中，與DSB形成相關的三個基因下調可能是導致突變體存在DSB形成異常表型的原因。這篇文章系統闡述了OsRDR6對於減數分裂DSB形成的重要作用機制，並突出多組學聯合分析之間互作關係，十分值得借鑑。

參考文獻

Liu CZ, Shen Y, Qin BX, et al. Oryza sativa RNA-Dependent RNA Polymerase 6 Contributes to Double-Strand Break Formation in Meiosis[J]. Plant Cell, 2020, 32: 3273-3289.

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