為什麼你的 qPCR 重複性差?靈敏度低?擴增易受抑制?

相信做 qPCR 的研友經常會碰到以下令人抓狂的時刻：

三個重複的 Cqmax 和 Cqmin 能差到兩個循環；提的樣本中總是含有很多 PCR 抑制劑，導致 Cq 值偏大；極低豐度樣本的 Cq 值總是遊走在 40 和 N/A 邊緣，讓人崩潰；絕對定量時需要的標準品既沒有商品化，自己製備起來又很費時費力……

數不勝數的坑，等著有人來跳……

那真的束手無策了嗎？

其實歸結起來，qPCR 實驗中碰到的難題無非是重複性差、擴增易受抑制、靈敏度低和需要標準曲線等，接下來介紹的Digital PCR（數字 PCR）就可以完美的解決這些問題！

數字 PCR 是什麼？

數字 PCR 是一種新型的核酸（DNA、cDNA 或 RNA）定量技術，它採用有限稀釋的方法，使用泊松分布分析數據從而得到靶標的絕對拷貝數濃度。

數字 PCR 實驗中，一個完整的 qPCR 反應體系（包括模板、DNA 聚合酶、引物、探針等）被分隔為若干個（通常數萬個到幾百萬個）獨立的反應區間（納升級體積），經過 PCR 擴增後，包裹有靶標 DNA 的反應區間會發出螢光信號，標記為陽性；反之為陰性。

最後根據陰性反應區間的比例經過泊松分布計算得到靶標 DNA 的拷貝數濃度。

圖片來源：Analytical chemistry

其實數字 PCR 不算是新技術了，它的原型可以追溯到 1992 年。Sykes 等報導了基於樣品有限稀釋和泊松分布數據處理的巢式 PCR 定量技術，並提出了數字 PCR 的構想 [1]。

1999 年，Vogelstein 和 Kinzler 採用 96 孔板系統發展了微升級的 PCR 擴增方法，用於結腸癌的突變基因 ras 的定量分析 [2]，使數字 PCR 的應用實踐成為了可能。

後來晶片蝕刻技術和微流控技術的發展，使得數字 PCR 真正有了用武之地。

圖片來源：文章截圖

數字 PCR 的優勢

相較於 qPCR，數字 PCR 有以下優勢：

1. 真正的絕對定量，無需標準品和標準曲線；

2.不再像 qPCR 那樣嚴重依賴於擴增效率，對 PCR 抑制耐受程度高，模板適用度廣；

3.更高的解析度，能夠區分 1.1 倍的濃度差異，適合高拷貝數的 CNV（16 copy vs 18 copy）實驗；

4.更高的靈敏度，可以檢測到單拷貝的靶標，適合單細胞基因表達等研究。

5.重複性好，intra-assay 和 inter-assay 的 CV 較 qPCR 低 [3]。

數字 PCR 實驗的操作

數字 PCR 的實驗無需太過複雜的操作，但需要相關設備的輔助才可以實現。數字 PCR 從 partition 製備方式上分為晶片式和微滴式，操作大同小異，一般分為以下幾步：

1. 配置 Reaction Mix。包含引物、螢光探針或者染料、模板和 DNA 聚合酶，不同廠家對體積要求也不一，一般 15-25 μl。2. Partition 分隔。通過晶片或者微流控設備將配好的體系處理成 10000-30000 個 partition，不同的廠家其 partition 的數量也不同。3. PCR 擴增。使用普通的 PCR 循環儀或者平板擴增系統將生成的 partition 進行擴增。4. 讀取數據。使用 CCD 拍照方式或者流式細胞術技術對 partition 進行信號讀取，最後軟體根據陰性的 partition 比例計算得到靶標的濃度，單位是 copy/μl。

數字 PCR 的應用

目前數字 PCR 的應用已經非常成熟，通俗的講，qPCR 能做的，數字 PCR 輕鬆加愉快，qPCR 做不到的，數字 PCR 也可以勝任。

SNP 方面，與疾病的分子標誌物檢測相關的文獻多如過江之鯽，尤其是非小細胞肺癌相關的 EGFR 突變。Oxnard 等使用數字 PCR 技術監測血漿中 EGFR 敏感突變和耐藥性突變（T790M）[4]。

基因表達方面，已經深入到單細胞的水平。Albayrak 等使用數字 PCR 研究單細胞基因的轉錄組豐度和蛋白組豐度的相關性 [5]，其中用到的鄰位連接技術 PLA 很有新意，將低豐度蛋白的檢測轉化為相對容易的 DNA 檢測。

CNV 方面，數字 PCR 可以用於檢測皮膚中體細胞的拷貝數嵌合現象[6]。

當然也有其他方向的各種新奇應用，比如四種不同 RNA 剪接體的同時檢測[7]，將 T4 單細胞包進 partition 中進行 HIV 病毒庫的檢測 [8] 等。

套用句過時了的話：只有你想不到的，沒有數字做不到的。