責編 | 逸雲
細胞是生物體結構和功能的基本單位.為了細胞中各種生物化學反應的快速高效完成，細胞進化出了一系列的細胞器，包括有膜包裹的（比如線粒體，細胞核，溶酶體等）和無膜包裹的細胞器（核仁等）。有膜包裹的細胞器將特定蛋白、核酸等物質包裹起來，以在特定的空間內執行其功能.這些無膜細胞器沒有細胞膜包裹，但是仍能穩定存在，並與周圍環境產生頻繁的分子交換。無膜細胞器如何形成以及其物理化學本質，是困擾了大家多年的問題。而相分離（liquid–liquid phase separation, LLPS）提供了一個形成此類細胞器的機制：某些蛋白質或者核酸分子可以通過多價相互作用，在原本均一的環境中產生物理化學性質不同的另一相，形成無膜細胞器或者是細胞結構。在絕大多數情況下，這些細胞結構呈現液態特徵，所以被稱為液滴（liquid droplet）或者是液態凝聚體（liquid condensates）。
liquid–liquid phase separation
近年來，相分離領域已經成為生命科學領域研究的大熱點。生物學中很多不能解釋的過程，可能都會被這種自組裝的方式調控。相分離在生物體內多種方面都發揮作用，比如基因表達調控、細胞分裂以及脅迫響應等等。最近兩年，有關相分離在植物中的研究也取得了一系列重要進展，研究成果大都發表在CNS主刊上。為方便研究人員查閱，我們把相關工作做了以下匯總：
2020年8月，英國劍橋大學Philip Wigge團隊在Nature在線發表了一篇題為A prion-like domain in ELF3 functions as a thermosensor in Arabidopsis的研究論文。該研究發現擬南芥ELF3通過PrD（prion-like domain）介導的相變感受環境溫度變化，使ELF3成為一個新的熱感受器。
ELF3的PrD區域含有polyQ（polyglutamine）重複序列。研究發現polyQ重複序列的長度與熱響應性相關。二穗短柄草（Brachypodium distachyon）的ELF3（BdELF3）缺少PrD區域，能夠回補擬南芥elf3突變體在正常溫度（22°C）下的表型，但是卻不能回補在高溫（27°C）下提早開花的表型。這說明，PrD對於ELF3在溫度反應中起關鍵作用。以前的研究發現，酵母中含有PrD蛋白會發生相分離現象：蛋白溶液具有類似油水混合物的凝集相和稀釋相。對擬南芥ELF3進行了體內和體外分析發現，ELF3蛋白也顯示出了溫度相關的相分離現象：在低溫下，ELF3在細胞內彌散分布；當溫度升高時，ELF3聚集成點狀；當溫度再次下降，這些斑點會恢復到彌散狀態。而BdELF3在相同條件下沒有發生相分離，說明ELF3的相分離取決於PrD的存在。總之，PrD介導的ELF3相分離能夠感知環境溫度變化，這是一種全新的溫度感知機制。
A mechanism that enables plants to respond to high temperatures
論文連結：
https://doi.org/10.1038/s41586-020-2644-7
2020年3月，中國科學院植物研究所/河南大學生命科學學院張立新教授研究團隊在Cell發表了題為Liquid-Liquid Phase Transition Drives Intra-chloroplast Cargo Sorting的研究論文，首次提出並闡明了相分離驅動葉綠體內蛋白分選的新機制。該研究發現了位於葉綠體基質的關鍵蛋白轉運分選因子STT1與STT2，闡明了雙精氨酸依賴轉運途徑的底物識別、分選以及轉運靶定到雙精氨酸依賴轉運途徑的分子機制。
STT1與STT2蛋白都包含N端的IDR (intrinsically disordered region) 結構域與C端的ankyrin repeat結構域。STT1與STT2能夠依賴於ankyrin repeat結構域的相互作用形成一個橢圓球狀異源二聚體結構，而STT1與STT2的IDR區域分別含有保守的WEEPD基序與LVP-W基序，負責識別底物信號肽的雙精氨酸（RR）基序與疏水結構域（H domain）。研究表明，底物結合後會激活STT複合物進一步組裝相分離形成濃縮的液滴。STT-底物相分離液滴協助底物穿過葉綠體基質從而靶定到類囊體膜。而Hcf106能夠抑制STT的相分離從而釋放底物，完成底物的正確運輸與裝配。這種方式可能既能確保底物摺疊，同時保持底物信號肽的活性便於被下遊Tatc/Hcf106通道識別。阻礙STT-Hcf106結合會阻斷Tat底物的運輸，影響植物光合作用從而導致植物致死的表型。該研究提出並闡明了相分離驅動葉綠體內蛋白分選的新機制，推動了蛋白轉運機理的進一步深入，揭示了相分離的重要生理意義，而且對於探討葉綠體的生物發生、光合器官的建成和功能調節以及真核生物的起源和進化等都具有重要的意義。
Model for STT-Mediated Substrate Protein Delivery to the CpTat Translocon through Liquid-Liquid Phase Separation
論文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.045
2019年5月，英國 John Innes Centre的Caroline Dean研究組與清華大學李丕龍研究組合作在Nature發表題為Arabidopsis FLL2 promotes liquid-liquid phase separation of polyadenylation complexes的研究論文。該研究發現擬南芥coiled-coil蛋白FLL2介導RNA 3』末端加工因子的相分離，從而促進特定基因的3』末端形成。
在該研究中，研究人員首先發現調節擬南芥開花的關鍵蛋白FCA能夠形成nuclear bodies。有意思的是，FCA蛋白含有prion-like結構域且大部分區域高度無序，這是大部分能夠發生相分離的蛋白所共有的兩個特徵。這一發現讓研究人員猜測FCA能夠發生液-液相分離從而形成nuclear bodies。體內實驗結果證明了這一猜測：FCA形成的nuclear bodies具有液滴的性質。體外重組的FCA prion-like結構域很容易發生相分離形成液滴，然而全長FCA蛋白卻不能，暗示在細胞內FCA的相分離還需要其它因子的幫助。為了探究這一現象，研究人員利用正向遺傳篩選發現coiled coil蛋白FLL2是FCA發揮功能所必須的。有意思的是，FLL2與FCA共定位於nuclear bodies中。進一步研究發現，fll2突變體中FCA 幾乎不能形成nuclear body，而過表達FLL2能夠明顯使FCA形成的nuclear body增大增多，說明FLL2能夠在體內幫助FCA發生相分離形成nuclear bodies。基於以上結果，研究人員認為FCA通過液-液相分離形成nuclear bodies，這些亞細胞結構能夠富集3』末端加工因子，從而促進特定RNA的3』末端加工。該研究揭示了RNA3』末端加工的新機制，並首次發現coiled coil蛋白在液-液相分離中起重要作用，加深了我們對相分離機制的理解。
A working model for the role of the coiled-coil protein FLL2 to promote nuclear bodies that are important for polyadenylation at specific sites
論文連結：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-1165-8
2019年2月，賓夕法尼亞大學Alison M. Sweeney研究組在Cell上發表題為Pollen Cell Wall Patterns Form from Modulated Phases的研究論文。該研究根據花粉表面多糖中可能存在的非穩態的相分離特性對於不同植物花粉表面的多樣性進行分析，建立了一個統一的物理學模型。
為了探究初生外壁在花粉表面模式形成的作用以及該過程中是否存在相分離的現象，作者首先找到了一個合適的植物模型：西番蓮 （Passiflora incarnata） ，之所以選擇西番蓮因為其花藤數量豐富並且花粉發育的各個時期連續且容易觀察。作者將西番蓮的花粉發育過程分為六個階段：第一階段，減數分裂之後初生外壁形成之前；第二階段初生外壁開始形成；第三階段，初生外壁變得不均一；第四階段，初生外壁不均一性增加，花粉細胞膜形態開始波動；第五階段，初生外壁形成達到發育完全的階段，初生外壁與細胞膜之間產生明顯的界限，幾何形狀變得規則；第六階段，花粉外壁以及表面模式形成完全。其中第五階段中最初是不均一形態的初生外壁形成兩層空間上分離的密度不同的層，對於作者提出的初生外壁隨著花粉細胞的成熟發生相分離的理論提供了強有力的證明。為了確認初生外壁中存在的相分離在花粉初生外壁模式形成中的作用，研究組將此生物學過程模擬成為一個物理學的相變過程。研究發現花粉初生外壁的模式形成過程中，相分離達到穩態之前會進入一個動力學阻滯 （Kinetic arrest） 階段，並且根據此模型對現存的部分植物進行分類後發現，能夠處於此種動力學阻滯過程中的植物，在進化過程中花粉初生外壁模式形成過程更不保守，進化過程更快。 該研究在微米以及納米尺度上對於花粉發育過程給出了一個有效的可能存在的機制。此工作中提出的框架也可能為一些其他的表面結構例如細胞壁以及昆蟲角質層形成模型模擬提供參考。
Pollen Cell Wall Patterns Form from Modulated Phases
論文連結：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.01.014
2018年1月，德國馬普生化所Manajit Hayer-Hartl課題組在Nature雜誌在線發表了題為Rubisco condensate formation by CcmM in β-carboxysome biogenesis的研究論文，報導了Rubisco-CcmM複合物結構，並且通過生理實驗驗證了Rubisco在β-羧酶體生物發生過程中由CcmM介導的相變過程的分子機制。
該研究首先從解析了 藍細菌 Synechococcus elongatus中CcmM的SSUL1的晶體結構，解析度為1.65 。SSUL1與此前報導的RbcS結構同源，但是序列不同源。並且，此結構是氧化狀態下的結構，可以看到Cys261和Cys279之間的二硫鍵。同時，他們也解析了還原狀態下的SSUL1結構，解析度為1.2 ，除了沒有二硫鍵，其他與氧化狀態下一致。通過生化實驗，他們發現Rubisco和M35按一定比例 （1:8） 混合會變渾濁，形成聚集網絡，並且驗證該複合物是有功能的。但同時也發現，不管是單獨的SSUL，還是M13-1，M13-2 或M13-3，都不能形成該網絡；只有M24-1/2 （SSUL1 and SSUL2） 組合才能介導Rubisco網絡形成。接著他們發現Rubisco-M35的網絡動態特性表明這些蛋白質經歷了液-液相分離 （Liquid–liquid phase separation, LLPS） 。通過螢光實驗，將Rubisco和M35red按一定比例組合，可誘導分層成圓形螢光冷凝物，平均Feret直徑為約1.3 μm，符合液滴的特徵，確定是LLPS。與Rubisco在綠藻類澱粉核 （pyrenoid） 中的行為類似，在更具活力的氧化條件下，M35可將Rubisco濃縮成液體基質，與羧酶體中的狀態一致。研究發現，在晶體結構中看到的SSUL中的二硫鍵對於羧酶體的生物學功能很重要，它增加了基質網絡的靈活性，並且是體內羧基體功能所必需的。突變掉相關的Cys會導致羧酶體對CO2的需求增加約10至20倍，倍增的時間增加約2至2.5倍。為了解M35-Rubisco相互作用的分子基礎，他們通過cryo-EM和單粒子分析解析到了複合物結構。他們在Rubisco「赤道」附近發現了額外的電子密度，通過結構修正，解析了2.77 完整的Rubisco–SSUL複合物結構。結構顯示4個SSUL模塊結合一個Rubisco，與RbcL二聚體和RbcS之間的界面通過鹽橋、範德華力等作用力互作。同時，他們發現SSUL與RbcS的互作對此前發現的Rubisco網絡的形成非常重要。因此，Rubisco的液體狀縮合物的形成是通過與SSUL結構域的動態相互作用介導的，而不是通過低複雜性序列介導的。
Cryo-EM structure of Rubisco–M35 complexes
論文連結：
https://doi.org/10.1038/s41586-019-0880-5
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