以網絡互作角度再看多隊列的腸道微生物

文獻速遞

本文基於宏基因組學的網絡分析方法，對來自荷蘭的 4 個隊列的 2379 個個體（1個IBD 隊列(n = 496)、1 個肥胖隊列 (300OB; n = 298)、2 個人群隊列 (Lifelines-DEEP (LLD; n = 1135) 和500 Functional Genomics (500FG; n = 450)) 中的細菌種類和代謝途徑進行了分析，比較了不同宿主健康條件下的微生物分類學和功能網絡形成宿主相關微生物網絡的潛在關鍵物種和途徑。

發現 ① 38.6% 的菌種共豐度關係和 64.3% 的功能途徑共豐度關係的強度，在不同隊列間有顯著差異；② 113 個菌種共豐度和 1050 個途徑共豐度具有 IBD 特異性（用iHMP-IBD 隊列數據進行了驗證），281個途徑共豐度呈現肥胖特異性；其中，IBD 關鍵的物種有 3 個，pathway 4 個，以及肥胖中關鍵 pathway 1 個。這啟示疾病相關菌群失調可反映在微生物共豐度關係的變化上。

Keywords: Gastrointestinal system；inflammatory bowel；disease；metabolic disorders

Title: Gut microbial co-abundance networks show specificity in inflammatory bowel disease and obesity

DOI: 10.1038/s41467-020-17840-y

Journal: Nature Communications [IF 12.121]

First Authors: Lianmin Chen

Correspondence: Jingyuan Fu

Affiliation: Department of Genetics, University of Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, the Netherlands.

Published: 2020-08-11

研究背景

近些年來的研究表明了腸道菌群影響著人類的健康，這種關聯很大程度上歸因於微生物群的代謝和免疫信號進入循環系統。已表明肥胖、糖尿病與腸道微生物密切關聯，其中微生物是循環血脂水平主要驅動者。微生物對各種胺基酸關係也在糖尿病和心血管疾病有報導。人腸道微生物與宿主關係密切，它們參與營養物質的消化降解，維護的消化道完整性，刺激宿主免疫系統和調節宿主新陳代謝。

雖然現在有很多研究發現人類疾病如肥胖、糖尿病、心血管疾病、慢性胃腸疾病如 IBD 等都腸道微生物有關係，但是這些研究都是基於微生物組成豐度的變化與疾病的關係，但是腸道微生物是一個複雜的生態系統。

因此，目前有多種網絡互作的工具應用於研究疾病微生物之間互作關係，但是目前這些應用也是限於 16S 的研究，這就限制了更為精確的物種和功能分析。

因此，本文就基於宏基因組學的網絡分析方法，對來自荷蘭的 4 個隊列的 2379 個個體（1個IBD隊列(n = 496)、1 個肥胖隊列(300OB; n = 298)、2 個人群隊列 (Lifelines-DEEP (LLD; n = 1135) 和 500 Functional Genomics (500FG; n = 450)) 中的細菌種類和代謝途徑進行了分析，比較了不同宿主健康條件下的微生物分類學和功能網絡形成宿主相關微生物網絡的潛在關鍵物種和途徑。

研究思路

Fig. 1 Analysis workflow of the present study.

研究結果

1. 構建腸道微生物供豐富度網絡

本文用的2379 個宏基因組樣品都採用同樣的分析流程。

PCA 分析顯示不同隊列之間有大部分的物種和 pathway 重合，雖然 IBD 有個別的特異物種 (Supplementary Fig. 2)。

選用至少在一個隊列中存在率 >20%的物種（134個）和 pathway（343）分析網絡互作。物種水平，一共產生 3454 共豐度物種對（LLD : 2604 ; 500FG: 1591; 300OB: 1107; IBD: 2554）(Fig. 2a), 82.1% 的共豐度物種對也是共出現物種對 (Supplementary Fig. 3)。pathway水平，一共產生 43,355 共豐度物種對（LLD : 40,699; 500FG: 37,279; 300OB: 37,699; IBD: 37,279）(Fig. 2b), 但是只有 29.6 % 的共豐度物種對也是共出現物種對(Supplementary Fig. 3)。

Cochran-Q test 檢驗發現 38.6% 和 64.3% 共豐度物種和 pathway 存有隊列差異，也驗證了作者認為不同隊列的共豐度的互作關係有差異的假設。

Fig. 2 Microbial co-abundance networks in each cohort.

Supplementary Figure 2. Principal component analysis of microbial species and pathways.

Supplementary Figure 3. Overlapping of microbial co-occurrence and co-abundance networks.

2. 共豐度微生物的豐度差異

檢驗發現 100 物種和 304 pathway中有 76% 的物種和 84% pathway 在不同隊列間有差異。這暗示的多樣的共豐度關係反映出它們豐度差異。

從豐度差異的物種屬水平間的互作關係和屬內物種的互作關係數量來看，發現 Streptococcus 無論是屬內不同物種間，還是屬間主要和Eubacterium 和 Veillonella 都有大量的共豐度對 (Fig. 3a)。同樣，pathway 也能觀察到類似的結果，異質性最高的 pathway是胺基酸合成，它與核苷和核苷酸合成 pathway 之間關係對也很多(Fig. 3b)。

Fig. 3 Differential and cohort-specific microbial co-abundances.

3. 特異的共豐度物種集中於疾病隊列

接著作者分析是否存在某些差異的關係對主要存在一個隊列中，其他隊列極少。校正年齡和性別之後，120 個共豐度物種和 1448 個共豐度 pathway 依然顯著隊列差異 （FDR of 7.6%）。而且絕大部分的關係對集中在疾病隊列中，IBD 隊列富集 113 (94%) 共豐度物種和 1050 (72%) 共豐度 pathway；300OB 隊列富集 281 (19.4%) 共豐度 pathway，而人群隊列則很少的特有共豐度對，LLD 和 500FG 中只有 3 共豐度物種和 117 共豐度 pathway (Fig. 3c, d)。這結果表明了，微生物的共豐度取決於宿主的健康狀況和疾病狀況。

4. IBD 的微生物共豐度網絡互作

本研究的 IBD 隊列中一共有 2554 個共豐度物種和 37,699 個共豐度 pathway，iHMP-IBD 隊中從 77 個 IBD 個體中評定出 2090 個共豐度物種和 37,106 個共豐度 pathway。在 iHMP-IBD 隊列的基線樣本中，只重現了 531 個（25.4％）共豐度物種和 21,882（59.0％）共豐度 pathway。相對較低的重現率是和樣品數量有關的，因為整體比較，本研究的 IBD 和 iHMP-IBD 有 1705（81.6％） 共豐度物種和 24,165（65.1％）iHMP-IBD 隊列的第一個時間點和最後一個時間點（相距約1年）之間的 IBD 網絡比較顯示 90.6％ 的共豐度物種和 99.6％ 的共豐度 pathway 都重現了（Supplementary Fig. 6）。這就說明了 IBD 相關的共豐度對在不同 IBD 隊列和不同時間點都比較穩定。

Supplementary Figure 6. Replication of the IBD network using longitudinal data from the iHMP-IBD cohort.

接著作用從疾病亞型（ulcerative colitis (UC, n = 189) vs. Crohn’s disease (CD, n = 276)）、疾病位置（ileum (n = 212) vs. colon (n = 286)）、疾病狀態（inflammation (n = 121) vs. no inflammation (n = 377)）三個疾病特徵尋找與共豐度對之間關係。發現大部分的關係對都是相同的，只有少部分在不同疾病特徵中顯著差異 (Supplementary Fig. 7)。即 16 個共豐度物種，91 個共豐度 pathway 與疾病亞型相關；8 個共豐度物種，24 個共豐度 pathway 與疾病位置相關；3 個共豐度 pathway與疾病狀態有關。其中，5 個關係對與丁酸產生有關；與CD 相比較，Faecalibacterium prausnitzii 與UC關聯；F. prausnitzii 與已經潛在病原菌 Haemophilus parainfluenza 負相關。

Supplementary Figure 7. IBD co-abundances in relation to sub-phenotypes.

隨後，作者還分析了藥物使用於關係對的關係。IBD 隊列抗生素 (20.0%) 和PPIs (PPIs; 26.5%) 的使用率比一般人群隊列 (1.1% and 8.4%) 高。這裡沒有觀察到與抗生素使用相關的關係對，但是 3.7%(37,959中的1049) 的共豐度 pathway 與 PPIs 使用有關，特別是異戊二烯的生物合成和甲基赤蘚糖醇磷酸 pathway 有關

上述已經找到 113 和 1050 個 IBD 特有的共豐度物種和共豐度 pathway，隨之作者確定出 3 個核心物種和 4 個核心 pathway 與 IBD 高度相關(Fig. 4)。

Fig. 4 Cohort-specific species and pathway co-abundances.

這 3 個 IBD 核心物種是大腸桿菌（Escherichia coli）, 草酸桿菌（Oxalobacter formigenes） 和放線菌（Actinomyces graevenitzii），E. coli 和 O. formigenes 先前已有報導和 IBD 有關。同時發現 E. coli 與促炎相關物種如 Streptococcus mutans 正相關，與抗炎相關物種如 F. prausnitzii 負相關。A. graevenitzii 則是經常被報導出現在口腔和呼吸道中。

4 個IBD 核心 pathway 分別是 C1 化合物利用和同化途徑（P23-PWY：還原三羧酸（TCA）循環I），兩個維生素生物合成途徑（FOLSYN-PWY：四氫葉酸生物合成和挽救的超途徑）和PWY-6612：四氫葉酸生物合成的超級途徑）和胺基酸生物合成途徑（PWY-5505：L-穀氨酸和L-穀氨醯胺生物合成）。TCA 還原循環是一種二氧化碳固定途徑，已知用於糖，脂，胺基酸，嘧啶和甲萘醌生物合成的有機分子生產的主要途徑 (Fig. 5a)。這裡，甲萘醌（也被稱為維生素K2）生物合成 pathway (PWY-5837) 也是一條 IBD 特有物種關聯的pathway，只不過是 PWY-5837 在 IBD 的關聯強度比其他三個隊列要弱，雖然它的豐度在 IBD 是最高的(Fig. 5b)。

大腸桿菌是甲萘醌生物合成的重要物種，甲萘醌是腸道微生物群中各種微生物的生長促進因子。本研究數據也顯示 IBD 患者中大腸桿菌貢獻了 18.8% 的甲萘醌生物合成，比基線人群隊列高 2 倍。這就表明了大腸桿菌是 IBD 中甲萘醌生物合成的重要貢獻者，可能促進其他微生物的生長。

同時，大腸桿菌還與 15 個 IBD 特有物種相關，其中，與炎症相關的鏈球菌種類的強正相關，包括 S. mutans, Streptococcus vestibularis 和Streptococcus infantis(Fig. 5d)。因此，與其他隊列相比，IBD 中甲萘醌生物合成與鏈球菌之間的相關性更高 (Fig. 5e)。

Fig. 5 Menaquinone biosynthesis related to Streptococcus overgrowth in IBD.

5. 300OB 的微生物共豐度網絡互作

300OB 中找到 1107共豐度species 和37,886 共豐度pathway，從LLD 隊列中抽年齡和BMI 都匹配的 134 個肥胖個體重現300OB的關係對，其中991 (89.5%) 共豐度物種和 32,963 (87.0%)共豐度 pathway沒有顯著差異。

300OB本來是涉及研究肥胖個體的心血管疾病的，包括了139例動脈粥樣硬化斑塊和159例肥胖對照人群。這裡只找到了3個pathway與是否有斑塊有關。Dorea longicatena 與 Dorea formicigenerans 正相關，Lachnospiraceae bacterium 9.1.43BFAA 與Coprococcus comes 和D. longicatena負相關。

與其他3個隊列比較，300OB隊列中，有281 共豐度pathway顯著差異。其中一個肥胖核心 pathway 是尿囊素的降解（PWY0-41）與肥胖症相關的85個pathway相關。

尿囊素存在於各種植物如山藥，它能增強胰島素分泌和降低血漿葡萄糖。同樣的，在本研究中，發現尿囊素降解途徑與草醯乙酸/天冬氨酸（包括賴氨酸，高絲氨酸，甲硫氨酸，蘇氨酸和異亮氨酸）的生物合成途徑和天冬氨酸的生物合成途徑(PWY0-781)強負相關(Fig. 6)，它們與空腹血糖水平正相關，並與空腹胰島素水平負相關。

Fig. 6 Allantoin degradation pathway links to glycaemia in obesity.

結果與討論

本文從2個基線人群隊列，2個疾病隊列的物種網絡互作關係和功能網絡互作關係中找到了一些於IBD 和肥胖相關的物種或功能互作關係。

雖然本研究有大量樣品和兩種獨立網絡互作算法得到一些與疾病相關的物種或者功能，但這都只是基於計算機水平，尚缺驗證，和需要更多組學如宏蛋白組學、宏代謝組學更直接體現出微生物功能特徵。

本研究數據都是橫斷面研究，雖然iHMP-IBD 縱軸隊列中找到類似的發現，但是未來仍有必要進行縱向研究，並將其與功能驗證結合，確定更加精確的疾病標記物和了解疾病病理

參考文獻

Chen L, Collij V, Jaeger M, et al. Gut microbial co-abundance networks show specificity in inflammatory bowel disease and obesity[J]. Nature Communications, 2020, 11(1): 1-12.