基於表面等離激元共振顯微鏡的無標記單分子光學成像

2020-11-26 科學網

 

單分子光學成像可以分析單個分子的形態和功能，因此其不但可以提供多個分子的統計平均信息，還可以提供傳統生物傳感器無法提供的單分子個體差異信息，讓我們可以更細緻地觀測和了解分子的性質和功能。

2020年9月21日，亞利桑那州立大學生物設計研究院生物電子與生物傳感研究中心的陶農建（Nongjian NJ Tao）和王少鵬（Shaopeng Wang）教授的研究小組在Nature Method 發表了一種可以無標記檢測單個蛋白分子的新型光學顯微成像系統。論文的第一作者是張鵬飛（Pengfei Zhang）博士後研究員。

表面等離激元共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）是一種已被廣泛應用於無標記分子相互作用動力學測量的光學檢測技術。近年來發展起來的SPR顯微鏡提高了SPR檢測的空間解析度，實現了單個外泌體和病毒的成像分析。但是單分子精度的SPR顯微成像的實現仍然具有很大的挑戰。

雖然陶教授和王教授在二十年前就已經預測如果入射光足夠強，SPR是可以檢測到單個蛋白分子的，但是由於傳統SPR顯微鏡探測的是反射光，背景光比較強，而目前的高速相機即使在百瓦每平方釐米強度級別的入射光照射條件下也已經過曝。另一方面，由於蛋白分子的一般尺度在10納米級別，其散射截面很小，因此檢測信號極易被環境噪聲湮沒。

該研究小組通過在傳統的SPR顯微鏡上使用第二個物鏡來收集探測等離激元散射光的實驗設計克服了上述技術難題。該技術被命名為等離激元散射顯微鏡（Plasmonic Scattering Microscopy, PSM），技術示意圖如圖1a所示。

PSM顯微鏡避免了對反射光的收集，由此可以使用千瓦每平方釐米級別強度的入射光進行檢測，這是傳統SPR顯微鏡所用入射光強度的數千倍。這為高速成像提供了足夠強度的散色光信號，在保證時間解析度的前提下容許對多幅圖像數據進行平均降噪和差分成像處理，可以將環境噪聲影響降低到可接受的程度。

此外，在減去金膜表面粗糙顆粒造成的背景散射後，可以看出PSM圖像中，沒有出現傳統SPR顯微圖像中由於表面等離激元平面非局域性幹涉導致的拋物線形尾巴，這提高了圖像的對比度並極大降低了數據處理難度。

圖1 （a）等離激元散射顯微鏡技術原理圖。（b）左：原始PSM圖像。右：去除背景後在抗體修飾的金膜上檢測到的IgA蛋白分子。

在利用PSM顯微鏡進行成像時，信號強度變化趨勢如圖2所示可以分為兩種，一種為在檢測尺度100納米以上尺度的物體時，信號強度隨著物體直徑的六次方改變。這是由於這類物體的散射強度遠大於金膜表面粗糙顆粒的背景散射，信號由散射主導。第二種為當檢測尺度100納米以下的物體時，金膜表面粗糙顆粒背景散射已經遠大於分析物的散射，由此呈現出明顯的幹涉效應，信號強度隨直徑的三次方改變。

由於蛋白分子的尺寸普遍小於30納米，因此當PSM顯微鏡用於蛋白檢測時，其信號強度變化為典型的幹涉信號。表面粗糙顆粒散射這一在多數成像應用中被視作難以消除的噪聲源，在PSM顯微鏡中被成功用於放大檢測物信號的幹涉參考光。

圖2 聚苯乙烯納米球成像強度隨直徑的變化。

利用PSM顯微鏡的單分子光學成像能力，不但可以如圖3a所示通過分子計數方法獲得類似於傳統SPR檢測獲得的分子動力學曲線，還可以如圖3b-d所示檢測單個蛋白分子與抗體修飾金膜表面作用過程的異質性，從而為分子動力學分析提供更豐富的細節信息。此外，由於PSM顯微鏡是在SPR顯微鏡上構建的，所以PSM顯微鏡仍然保留了進行表面電化學監測、離子檢測和生化反應監測等SPR常見應用研究的能力。

圖3 （a）基於吸附分子計數獲得的分子動力學曲線。（b-d）單個IgA分子吸附行為的異質性。

該論文驗證了基於SPR顯微鏡構建的PSM顯微鏡進行單分子光學成像的能力，並驗證了PSM顯微鏡在非標記蛋白分子相互作用動力學測量中的應用可行性。PSM顯微鏡作為SPR傳感器家族的新成員，與其相關的表面粗糙顆粒散射與分析物散射之間相互作用具體過程以及表面等離激元平面非局域性的影響細節等的原理研究，以及單分子光學成像能力與SPR各個應用領域的深度結合的應用研究，都將成為SPR成像檢測領域的新課題，具有廣闊的研究和發展前景。

本項目的發起人陶農建教授是一位傑出的華裔科學家，在分子電子學、納米尺度光學成像，化學以及生物傳感器等研究領域中做出了重要貢獻（H-index 92: https://scholar.google.com/citations?user=T7GTq-QAAAAJ&hl=en）。陶教授在文章投稿後的2020年3月不幸離世。陶農建教授的紀念網站為：http://www.njtaoasu.org。（來源：科學網）

相關論文信息：DOI：10.1038/s41592-020-0947-0

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