3D列印微籠技術改善骨折與器官組織修復

2020-12-04 江蘇雷射產業創新聯盟

江蘇雷射聯盟導讀：

增材製造使再生醫學應用的支架設計和製造取得了重大進展。這對大組織損傷再生的改良支架材料工程特別有前景，這項技術旨在用於患者特定損傷的設計，根據缺損形狀、大小和3D結構複雜性進行修復。理想的支架系統不僅能與特定的缺陷結構兼容，而且還能簡單且針對位置與可控負載的生物製劑（即細胞，生長因子，水凝膠及其組合）兼容，以增強空間和時間控制移植組織中宿主組織的向內生長，即通過刺激正確類型的細胞在正確的位置和正確的時間生長來改善癒合。但迄今為止，解決這些標準的策略仍然難以捉摸。

該研究團隊開發了一種新的支架組裝系統，該系統利用了以剛性、中空和可堆疊的微型微籠模塊形式製造的3D印刷支架，類似於玩具互鎖積木(如樂高)的特徵，通過直觀的手動組裝過程，可以輕鬆、可擴展地配置複雜的幾何形狀。設計這種具有中空特徵的支架的能力能夠讓不同成分的材料可控得裝載，從而製造具有空間限定的指示性提示的支架。

研究人員為了評估這些3D列印的微型微籠模塊的功能，用常規玩具積木的設計方案來製造模塊。他們使用基於光刻的陶瓷製造（LCM）方法3D列印由高密度β-磷酸三鈣（β-TCP）陶瓷組成的裝有水凝膠的微籠支架。為此，中空尺寸為1.5 × 1.5 × 1.5mm、壁厚為230-560m的3.375mm3微籠修復單元被製造成1 × 1(圖1A-C,E)、2 × 2(圖1F)和4 × 4(圖1D,G)的修復單元垂直堆疊塊。模塊以多層疊置的方式組裝，具有不同的尺寸和樣品周邊一致的輪廓，有較大底部和較小頂部的半金字塔形狀(如圖1H,J)，有隨機定向的不規則輪廓(如圖1I)。舉例來說，這種可堆疊設計功能的變化使得僅4×4 × 4層模塊就能實現總共29,413種配置，這說明了用單個模塊組裝多結構的可能性範圍。

圖1. (A–C)從垂直，水平和正交的角度對1×1腳手架進行的原理圖設計。(D)4×4微籠支架的3D設計的正交投影。(E)單個1×1（左）和堆疊的微籠支架（右）的照片。(F，G)組裝了2×2和4×4設計的微籠支架。(H–J)組裝成半錐體形狀以及隨機定向的不規則輪廓的微型籠式支架的照片（比例尺：1.5 mm）。

中空微籠設計的另一個功能是能夠以空間可控的方式將材料裝載到支架上。構建具有異質結構通常需要複雜的方法，例如鎖定鍵形微凝膠的定向組裝、磁懸浮、引導的脫氧核糖核酸結合以及多油墨組織構建體的直接3D生物列印等等。為了證明製造具有不同組成的微凝膠支架結構的簡易性，使用水凝膠3D印刷方法來製造由甲基丙烯酸酯化明膠(GelMA)組成的立方體、螺旋、三角形、正方形、圓柱形、星形和五角形花狀幾何形狀的微凝膠(< 500m寬和長度)，這些微凝膠使用數字光處理3D印刷裝置(Ember，Autodesk)進行印刷。微凝膠是用不同組合的人重組生長因子(血管內皮生長因子，VEGF；血小板衍生生長因子，PDGF；骨形態發生蛋白-2，BMP2)；或帶有螢光標記的微粒(綠色、橙色和粉色)，以便於空間控制的可視化(圖2A、B、E、F)。這些微凝膠可以很容易地在潮溼或乾燥的條件下注射，或者手動裝載到單個微凝膠模塊中。

圖2. 顯示微凝膠在單個微凝膠單元(A，B)中的分布以及覆蓋微凝膠支架(C，D)的凝膠狀水凝膠的完全浸漬的3D圖。(E–H)上面示意性描述的微凝膠支架的照片，在加載了分別嵌入了微凝膠和整體水凝膠的螢光標記的微粒之後。(I，J)添加了生長因子的微凝膠在微凝膠支架內形成濃度梯度，引導細胞以位點特異性方式遷移，免疫螢光染色圖像(上圖:2D視圖，下圖:3D視圖)證實了這一點:(I)通過富含血管內皮生長因子的微凝膠(左)、無生長因子的微凝膠(中)、富含PDGF的微凝膠(右)引導細胞遷移，與(J)通過水凝膠浸漬組實現的非特異性細胞遷移相比。(比例尺:1.5毫米)。

為了檢查細胞向位於微籠支架不同區域的生長因子的位點特異性遷移，研究人員將細胞單層接種在位於3×1微籠支架上方的Transwell板中。一個微籠（左側）填充有VEGF的GelMA微凝膠，中間一個微籠填充了未添加的微凝膠，另一個（右側）填充了PDGF的微凝膠。結果表明遷移的模式遵循提示的趨化梯度（圖2I – K）。相對於裝有未添加微凝膠的微籠，VEGF對細胞特別有吸引力，並且刺激的細胞遷移明顯更多。這就表明一旦將其放置在骨損傷部位內，相鄰的骨細胞就會遷移到支架中，實質上是在其三維微觀結構中「棲息」。這些細胞然後繁殖，隨著無害生物降解而逐漸取代該聚合物。最終，剩下的就是純天然的骨頭。

研究人員為了比較載有微凝膠的微籠支架在體內刺激細胞向工程構建體核心遷移的能力，將兩疊4×4微籠樣品皮下植入大鼠模型，其結果是通常血管生長量的將近三倍。裝有微凝膠的微籠支架內每平方毫米的細胞總數比完全浸漬的樣品高約2.3倍（p <0.05）（圖3E）。此外，與完全浸漬的樣品相比，裝有微凝膠的支架中的血管總數平均增加了3.5倍（圖3F）（p<0.01），並且各組之間的平均血管直徑相當（圖3G）。

圖3. 與水凝膠浸漬樣品相比，肌動蛋白染色樣品的角度投影、頂部投影和正交投影顯示細胞滲透到整個微凝膠負載的微凝膠支架中，其中細胞主要位於支架表面。(C,D)組織學(甲苯胺藍染色)圖像顯示，與水凝膠浸漬的樣品相比，載有微凝膠的微凝膠支架的外圍和核心區域中的定向細胞遷移和新血管形成(用箭頭表示)，這表明在核心區域中幾乎沒有細胞和脈管形成的證據。(E)微凝膠支架中細胞分布的定量顯示，與完全浸漬的支架相比，微凝膠負載的微凝膠支架中每個支架的細胞數量增加了2.3倍(p < 0.05)。血管數和平均血管直徑分別顯示脈管系統增加了3.5倍(p < 0.001)，微凝膠支架和水凝膠浸漬的微凝膠支架之間形成的血管直徑相當。

研究人員表示，該技術還可用於治癒受癌症治療影響的骨骼、進行脊柱手術以及在插入牙科植入物之前加固頜骨。他們相信，這些塊也可以用不同的材料製成，然後可以用於修復軟組織。科學家們甚至希望，通過更多的研究，阻斷方法可以應用於製造移植器官。

該項目得到了美國國家牙科和顱面研究所、俄勒岡州臨床和轉化研究所(OCTRI)-生物醫學創新計劃(BIP)、密西根匹茲堡威斯資源中心再生醫學資源中心(MPWRM)、OHSU-UO合作種子項目和OHSU研究多樣性和包容性研究獎學金(OHSU-OFDR至C.M.F .)的部分資助。

本文來源：Ramesh Subbiah\Christina Hipfinger,3D Printing of MicrogelLoaded Modular Microcages as Instructive Scaffolds for Tissue Engineering,advanced magterials.23 July 2020.

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