本報訊（記者黃辛）中科院生化與細胞所李勁松研究組和第二軍醫大學附屬長徵醫院袁文課題組在一項最新的研究中，結合CRISPR-Cas9基因編輯技術和半克隆技術，實現了點突變小鼠的高效製備。相關研究成果日前在線發表於國際學術期刊《遺傳學報》。
建立點突變小鼠模型，尤其是致病基因點突變的小鼠模型，對研究基因的功能和疾病的致病機制至關重要，但是通過傳統的同源重組編輯胚胎幹細胞的方法耗時耗力。近年來，通過CRISPR-Cas9直接注射受精卵可以獲得到攜帶點突變的小鼠，但產生攜帶點突變小鼠的效率不高且存在個體基因型嵌合的現象。李勁松研究組的前期研究建立了小鼠孤雄單倍體胚胎幹細胞（AG-haESCs）及將其注入卵子獲得健康小鼠的半克隆技術，進一步優化該技術獲得了能穩定高效產生半克隆小鼠的單倍體幹細胞（又稱為「人造精子」），為快速製備攜帶目的點突變小鼠模型提供了新方法。研究人員首先採用攜帶點突變的單鏈寡脫氧核苷酸（ssODN，長度為99鹼基）作為修復模板與CRISPR-Cas9共同轉入單倍體細胞中，發現隨著目的突變位點與Cas9酶切割位點（即DNA雙鏈斷開位點）距離的增加，同源重組獲得攜帶突變位點細胞的效率急劇下降。當距離≥10bp時，採用ssODN為模板的效率低至無法檢測，無法獲得攜帶這些位點的突變細胞。為此，項目組構建了攜帶點突變的雙鏈載體作為模板（長度為258bp-2.1kb），發現可以顯著提高同源重組效率；同時，發現當載體長度在1-1.5kb時，同源重組效率最高。研究人員進而建立了攜帶點突變的單倍體細胞系，並通過卵子注射高效獲得攜帶目的點突變的小鼠模型。研究人員提出在致病點突變的模擬過程中，當突變位點與DNA雙鏈斷開位點距離＜10bp時，可以選用ssODN為模板；當突變位點與DNA雙鏈斷開位點距離≥10bp時，採用載體作為模板時會有較高的效率。
據悉，魏磊鑫和王修坤為本文共同第一作者。